Identifizierung und Charakterisierung neuer Cytomegalovirus-kodierter Interferon-Antagonisten

Interferone dienen der ersten Abwehr von Pathogenen und stellen eine frühe Herausforderung für Virusinfektionen dar. Cytomegaloviren haben daher mehrere Evasionsmechanismen gegen die Funktionen des Interferonsystems entwickelt. In der Forschung zu Cytomegaloviren und den gegen sie gerichteten Immunantworten wird das Maus-CMV (MCMV) als Modell eingesetzt. Dieser Arbeit vorausgehend wurde bereits gezeigt, dass von MCMV mindestens ein IFN-Antagonist kodiert wird, welcher die STAT1- abhängige Transkription von Interferon-stimulierten Genen (ISG) inhibiert. In einem Screening wurden aus einer MCMV-ORF Library zwei MCMV-kodierte Gene als potenzielle IFNγ-Antagonisten identifiziert. Diese Genprodukte sollten allgemein charakterisiert und bezüglich ihrer potenziellen Immunevasionsfunktion analysiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MCMV-kodierten Gene M33 und M34 nach einer ektopen Expression die IFNγ-induzierte Genexpression signifikant und dosisabhängig inhibieren. Auch die HCMV-kodierten Homologe UL33 und UL34 inhibierten die IFNγ- induzierte Genexpression signifikant. pM33 und pUL33 sind als virale G-Protein-gekoppelte Rezeptorhomologe mit konstitutiver Aktivität beschrieben. Für pM33 konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der IFNγ-induzierten Genexpression mittels eines G-Protein-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Für pM34 wurde eine nukleäre Lokalisation gezeigt, welche auf eine mögliche Funktion von pM34 als transkriptionellen Regulator, wie es für pUL34 publiziert ist, hindeutet. Für die Charakterisierung der Gene M33 und M34 und ihrer Bedeutung für die Virusreplikation wurden Virusmutanten mit einer vollständigen Deletion der ORFs M33 und M34 generiert. Entgegen bereits publizierten Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass M34 nicht essenziell für die MCMV-Replikation ist, ΔM34-MCMV jedoch in vitro bis zu 100-fach schlechter repliziert als das parentale wt-MCMV. Die Deletion der Gene M33 und M34 führte nicht zu einer erhöhten IFNγ-Sensitivität im Vergleich zu wt-MCMV, was darauf hindeutet, dass M33 und M34 nicht die einzigen MCMV-kodierten IFNγ-Antagonisten sind. Dennoch wurde in ΔM34-MCMV-infizierten Zellen eine stärkere durch IFNγ-induzierte Oberflächenexpression von MHC-I nachgewiesen als in wt-MCMV-infizierten Zellen. Dies bestätigt die Inhibition der IFNγ-induzierten Expression eines ISGs von M34 in infizierten Zellen. In vivo wurde nach 3 Tagen eine Replikation von ΔM34-MCMV in Milz, Leber, Nieren und Lunge nachgewiesen. Nach 21 Tagen war ΔM34-MCMV dagegen in den meisten Organen nicht nachweisbar. Dennoch wurden in den Seren aller Mäuse MCMVspezifische Antikörper detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass ΔM34-MCMV trotz einer stark eingeschränkten Replikation adaptive Immunantworten induziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass M33 und M34 Antagonisten der IFNγ-induzierten Genexpression sind und das attenuierte Deletionsvirus ΔM34-MCMV ein vielversprechender Kandidat für einen Lebend-Vakzin-Vektor im Mausmodell ist.
 

Interferons act as first line of defense against pathogens and establish an early challenge for viral infections. Cytomegaloviruses have evolved several mechanisms of immune evasion to overcome the interferon system facilitating a productive replication and spread throughout their host. The murine CMV (MCMV) is broadly established as a mouse model in cytomegalovirus infection research. Prior to this work, the existence of a MCMVencoded IFN antagonist targeting the STAT1-mediated transcription of interferon stimulated genes (ISG) has been observed. In a comprehensive screen of a MCMV ORF library two candidate genes have been identified. Aim of this study was to characterize these two candidate genes and their potential role in immune evasion. Following ectopic expression both MCMV-encoded Genes M33 and M34 significantly and dose-dependently inhibited the IFNγ-stimulated gene expression. The HCMV-encoded homologues UL33 and UL34 also significantly inhibited the IFNγ-stimulated gene expression. pM33 and pUL33 have previously been described as viral G protein-coupled receptors and displayed constitutive signaling capacity. Here, pM33 was shown to inhibit the IFNγ-stimulated gene expression independently of G protein-mediated signaling. As a transcriptional regulator, the HCMV-encoded pUL34 has been described to localize to the nucleus. In agreement with this, pM34 was detected in the nucleus of transfected and M34HA-MCMV infected cells, indicating a function as transcriptional regulator. For further characterization of M33 and M34 and their role in replication, recombinant virus mutants harboring deletions of the entire ORF M33 and M34 were generated. ΔM34-MCMV was replication competent, albeit strongly attenuated to 100-fold reduced replication compared to wt-MCMV, contradicting data published by others stating M34 as an essential gene. Deletion of both M33 and M34 did not reveal enhanced IFNγ-sensitivity, indicating the presence of additional IFNγ antagonists. However, infection with ΔM34-MCMV led to increased surface expression of MHC-I induced by IFNγ when compared to wt-MCMV, confirming a M34-mediated inhibition of an ISG in MCMV-infected cells. Replication of ΔM34-MCMV was detected 3 days post infection in spleen, liver, kidney and lungs of BALB/c mice. After 21 days ΔM34-MCMV was not detectable in most organs, in contrast to wt-MCMV. However, MCMV-specific IgG antibodies were present in sera of all ΔM34- MCMV mice. These results suggest an induction of adaptive immune responses despite attenuated replication. Taken together, this work revealed M33 and M34 as antagonists of IFNγ-stimulated gene expression and suggests ΔM34-MCMV as a promising candidate for a life attenuated vaccine vector in mouse models.
 

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