Entwicklung einer kapillarelektrophoretischen Analysenmethode zur Charakterisierung von zellfreien enzymatischen Reaktionen in miniaturisierten Produktionssystemen

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines miniaturisierten enzymatischen Reaktorsystems, dass im Rahmen einer Proof-of-Concept Applikation eine einfache in vitro Biosynthese der Grundbausteine MalCoA und AcCoA für die Herstellung potenziell antibiotisch wirksamer Substanzen der Naturstoffklasse der Polyketide mit zeitaufgelöster, automatisierter und quantifizierender CE-Analytik ermöglicht. Dazu wurde eine CZE-UV/Vis Messmethode zur Quantifizierung der Nukleotide AMP, ADP und ATP und der Coenzyme CoA, MalCoA und AcCoA in enzymatischen Reaktionsmatrices entwickelt, die mit geringsten Probenmengen ohne Probenvorbereitung auskommt und zeiteffiziente Analysen ermöglicht. Dabei wurde die Messmethode hinsichtlich Kapillardruck, Kapillarspannung, Kapillartemperatur, Art des Puffers, Pufferkonzentration und pH systematisch optimiert, sodass sich die Nukleotide, Coenzyme als auch der interne Standard cAMP vollständig separieren ließen. Anschließend wurden sequenzielle Mehrfachinjektionen von enzymatischen Matrices durchgeführt, die eine Reihe von Trennproblemen bei der Verwendung der entwickelten Analysenmethode verursachten. Durch eine Anpassung der Kapillardimensionen, der Injektionsparameter und der Konditionierungsbedingungen wurde die ursprüngliche Güte der Trennung wiederhergestellt. Anschließend wurde die Methode auf Basis der von der ICH bereitgestellten Richtlinien zur Validierung analytischer Methoden hinsichtlich Spezifität, Selektivität, Genauigkeit, Präzision, Linearität und Nachweisempfindlichkeit validiert. Mit Hilfe der CZE-UV/Vis Methode wurden die Stabilitäten der kritischen Analyten CoA, MalCoA, AcCoA und ATP evaluiert. Dabei stellte sich heraus, dass sich eine quantifizierte Dimerisierung von CoA in der enzymatischen Matrix durch die Zugabe von TCEP vermeiden lässt. Zudem wurde eine Hydrolyse bedingte Instabilität von AcCoA und MalCoA quantifiziert. ATP erwies sich unter gleichen Bedingungen hingegen als stabil. Im weiteren Verlauf wurden die zellfreien Enzyme Malonyl-CoA Synthetase Y3K-deGFP MatB, Malonyl-CoA Decarboxylase Y3K-mRuby MatA und Citratsynthase Y3K-eBFP CitZ hinsichtlich Spezifität, Kinetik und Nutzbarkeit zur Produktion der CoA-Fettsäureester CoA, MalCoA und AcCoA evaluiert. Dazu wurden sequenzielle Mehrfachinjektionen von Einzel- als auch Mehrenzymreaktionen durchgeführt und zeitaufgelöst quantifiziert. Dadurch wurde die Funktionalität der nativen Enzyme sowohl einzeln als auch im Verbund nachgewiesen, wobei keine Nebenprodukte beobachtet wurden. Anschließend wurden die Enzyme auf magnetischen Ni-NTA Beads immobilisiert und durch Wiederholung der zuvor mit nativen Enzymen durchgeführten Reaktionen die Funktionalität der immobilisierten Enzyme nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die Aktivitäten von nativen als auch immobilisierten Enzymen durch eine entwickelte und validierte Methode zur Inaktivierung der verwendeten Enzyme durch pH-Wert Änderung bestimmt. Final wurde ein in die CE integrierbarer miniaturisierter DurchflussMembranreaktor im Rahmen einer Proof-of-Concept Applikation für einfache in vitro Biosynthese von Citrat und der Polyketid-Grundbausteine MalCoA und AcCoA mit einem integriertem CoA-Recycling System entwickelt. Neben der direkten Kopplung des Reaktors mit der Analytik wurde ein Upscaling im Vergleich zu den bisherigen Batch Ansätzen und eine Arbeit im Durchfluss ermöglicht. Der Reaktor lässt sich kostengünstig produzieren, ressourcenschonend nutzen und unter definierten Reaktionsbedingungen betreiben. Vorteilhaft erwies sich die durch den sequenziellen Einsatz von mit Enzymen beladenen Filtereinheiten nachgewiesene Modularität des Reaktors und die potenzielle Wiederverwendbarkeit der Enzymeinheiten. Allerdings ergaben sich einige ungeklärte Fragestellungen hinsichtlich der Stabilität der Immobilisierung, da bei Mehrfachverwendung von immobilisierten Enzymen verringerte Aktivitäten nachgewiesen wurden. Ausstehend, aber Bestandteil aktueller Forschungen, ist die Kopplung des Reaktors an eine Free-Flow Elektrophorese (FFE) Einheit zur kontinuierlichen Separation der Produkte von der Reaktionsmatrix und die Integration einer zellfreien Polyketid-Synthase zur Herstellung eines potenziellen Wirkstoffs im Reaktorsystem.

This work describes the development of a miniaturized enzymatic reactor system that enables a simple in vitro biosynthesis of the building blocks MalCoA and AcCoA for the production of potentially antibiotically active substances within the natural product class of polyketides with time-resolved, automated and quantifying CE analytics in a proof-of-concept application. For this purpose, a CZEUV/Vis analytical method was developed for the quantification of the nucleotides AMP, ADP and ATP and the coenzymes CoA, MalCoA and AcCoA in enzymatic reaction matrices, which requires minimal sample amounts without any sample preparation and enables time-efficient analyses. The measurement method was systematically optimized with respect to capillary pressure, capillary voltage, capillary temperature, type of buffer, buffer concentration and pH, so that the nucleotides, coenzymes as well as the internal standard cAMP were completely separated. Sequential multiple injections of enzymatic matrices were then performed, which caused a number of separation issues when using the developed analytical method. Adjustment of the capillary dimensions, injection parameters, and conditioning method restored the original separation efficiency. Subsequently, the method was validated based on the guidelines provided by the ICH for validation of analytical methods in terms of specificity, selectivity, accuracy, precision, linearity and sensitivity. The CZE-UV/Vis method was then used to evaluate the stabilities of the critical analytes CoA, MalCoA, AcCoA, and ATP. It was found that quantified dimerization of CoA in the enzymatic matrix could be avoided by the addition of TCEP. In addition, hydrolysis-induced instability of AcCoA and MalCoA was quantified. ATP, on the other hand, was proved to be stable under the same conditions. In the further course, the cell-free enzymes malonyl-CoA synthetase Y3K-deGFP MatB, malonyl-CoA decarboxylase Y3K-mRuby MatA, and citrate synthase Y3K-eBFP CitZ were evaluated with respect to specificity, kinetics, and applicability for the production of the CoA fatty acid esters CoA, MalCoA, and AcCoA. For this purpose, sequential multiple injections of single as well as multi-enzyme reactions were performed and quantified in a time-resolved manner. This demonstrated the functionality of the native enzymes individually as well as in combination, and no by-products were observed. Subsequently, the enzymes were immobilized on magnetic Ni-NTA beads and the functionality of the immobilized enzymes was demonstrated by repeating the previously performed reactions with native enzymes. Furthermore, the activities of native as well as immobilized enzymes were determined by a developed and validated method for inactivation of enzymes by pH change. Finally, a miniaturized flow-through membrane reactor that can be integrated into the CE was developed as part of a proof-of-concept application for a simple in vitro biosynthesis of citrate and the polyketide building blocks MalCoA and AcCoA with an integrated CoA recycling system. In addition to direct coupling of the reactor with the analytical system, upscaling compared to previous batch approaches and working in a flow-through system was enabled. The reactor can be produced cost-effectively, used in a resource-saving manner and operated under defined reaction conditions. The modularity of the reactor, demonstrated by the sequential use of enzyme-loaded filter units, and the potential reusability of the enzyme units proved advantageous. However, some unresolved issues arose regarding the stability of immobilization, as reduced activities were shown with multiple uses of immobilized enzymes. Pending, but part of current research, is the coupling of the reactor to a free-flow electrophoresis (FFE) unit for continuous separation of products from the reaction matrix and the integration of a cell-free polyketide synthase for the production of a potential drug in the developed reactor system.

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