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Einfluss adenovirus-spezifischer Immunantworten auf die Immunisierung mit adenovirus-basierten Vektoren

Hrycak, Camilla Patrizia

Ad5-basierte Impfvektoren werden aufgrund ihrer hohen Immunogenität geschätzt, obwohl diese gleichzeitig ihren klinischen Nutzen limitieren kann. Bei Studien im Friend Virus-Modell wurde beobachtet, dass nach Immunisierung mit Ad5.Leader-Gag, der für das FV Leader-Gag-Protein mit dem darin enthaltenen, immundominanten CD8+ T Zell-Epitop GagL85-93 kodiert, keine CD8+ T Zellantworten induziert werden. Die Immunisierung mit einem Leader-Gag-kodierenden DNA-Plasmid resultierte hingegen in der Induktion GagL85-93-spezifischer CD8+ T Zellantworten, während in einem weiteren Experiment keine GagL85-93-spezifischen CD8+ T Zellen detektiert werden konnten, wenn das Plasmid neben GagL85 93 die beiden adenoviralen CD8+ T Zell-Epitope DBP418-426 und Hexon486-494 kodierte. Diese Ergebnisse unterstrichen einen suppressiven Effekt adenoviraler Epitope auf die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten, der in dieser Arbeit näher untersucht wurde. Während das H2 Db-restringierte DBP418 426 keinen negativen Einfluss auf die Induktion GagL85-93(H2 Db)-spezifischer CD8+ T Zellen hatte, wurde GagL85-93 vor allem durch das H-2Dd-restringierte Hexon486-494-Epitop dominiert. Da in H2 Db/b-Mäusen keine Immundominanz des Hexon486 494-Epitops über GagL85-93 festgestellt wurde, ließ sich auf die Konkurrenz aktivierter CD8+ T Zellen schließen. Durch Co-Immunisierung mit IL2- oder IL23-kodierenden DNA-Plasmiden konnte die Hexon486-494-bedingte Suppression GagL85 93-spezifischer CD8+ T Zellen partiell aufgehoben werden. Im Gegensatz dazu resultierte weder die Co-Immunisierung mit IL2- oder IL23-kodierenden Ad5-Vektoren, noch die Immunisierung von H2-Db/b-Mäusen mit Ad5.Leader-Gag in der Induktion GagL85 93-spezifischer CD8+ T Zellen. Dies wurde dem Vorkommen weiterer dominanter Epitope im Ad5-Vektor beigemessen und konnte mittels ELISpot-Assay bestätigt werden. Mithilfe der OVA-abgeleiteten Epitope Y3, Q4 und T4 wurde zudem gezeigt, dass eine Immunisierung mit schwächeren Transgen-kodierten Epitopen in stärkeren Ad5-spezifischen CD8+ T Zellantworten resultierte. Neben Vektor-induzierten Immunantworten wird die Effektivität Ad5-basierter Vektoren durch die weit verbreitete Ad5-Prä-Immunität beeinträchtigt. In Ad5-prä-immunen Mäusen konnten demgemäß nach Immunisierung mit Ad5.TxnGagL keine GagL85-93-spezifischen CD8+ T Zellen induziert werden. Eine Publikation über den Anstieg Transgen-bindender Antikörpertiter in Ad5-prä-immunen Mäusen widersprach jedoch einer vollständigen Eliminierung des Ad5-Vektors durch neutralisierende Antikörper und deutete auf fortlaufende Transgen-Expression hin. In eigenen Experimenten wurde kein negativer Einfluss Ad5-spezifischer CD4+ oder CD8+ T-Zellen auf die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten nachgewiesen, während GagL85-93-spezifische CD8+ T Zellantworten nach dem Transfer von Plasma aus Ad5-prä-immunen Mäusen inhibiert wurden. Weitere Versuche zeigten, dass Ad5-bindende Antikörper die Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellen nicht beeinträchtigten und eine Rolle bei der erhöhten Antikörperinduktion spielen könnten. Aufgrund ihrer phylogenetischen Unterschiede zu Ad5 wird angenommen, dass seltene Adenovirus-Typen von Ad5-neutralisierenden Antikörpern nicht beeinträchtigt werden. In dieser Arbeit wurden daher Vektoren basierend auf den seltenen Adenovirus-Typen Ad48 und Ad50 als Alternativen zu Ad5 evaluiert. Ad48- und Ad50-basierte Vektoren waren nur hinreichend zur Induktion Transgen-spezifischer CD8+ T Zellantworten geeignet. Durch Immunisierung mit Ad48.Leader-GagC1K oder Ad50.Env konnte dennoch ein vergleichbarer Schutz vor einer FV Infektion erzielt werden, wie nach der Immunisierung mit dem entsprechenden Ad5-Konstrukt. Dieser Schutz basierte vermutlich auf der Induktion von CD4+ T Zell- und Antikörperantworten. Die Immunisierung mit Ad48 und Ad50-Vektoren induzierte allerdings Vektor-neutralisierende Antikörperantworten, die gegen beide Typen kreuzreaktiv waren. Prä-Immunität gegen Ad5 beeinflusste die Immunisierung mit Ad48-Vektoren nicht negativ. Im Gegensatz dazu war die Effektivität Ad50-basierter Vektoren in Ad5-prä-immunen Mäusen, vermutlich aufgrund kreuzreaktiver Antiköper, ähnlich eingeschränkt, wie die von Ad5-basierten Vektoren. Anti-Vektor-Immunität kann sowohl in Form von Vektor-induzierter Immunität als auch von Prä-Immunität gegen Ad5 maßgeblich den Ausgang Adenovirus-basierter Impfungen beeinflussen. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Notwendigkeit einer gründlichen Charakterisierung des Immunogens, sowie des Impfvektors bei der Entwicklung Adenovirus-basierter Vakzinierungsstrategien für die Anwendung im Menschen.

Immunization vectors based on an adenovirus type 5 (Ad5) backbone are valued for their high immunogenic potential, a characteristic which simultaneously limits their clinical use. Immunization studies in the murine Friend retrovirus (FV) model have shown that FV Leader-Gag protein delivered by Ad5 did not lead to induction of CD8+ T cell responses against the known immunodominant epitope, Leader-Gag-derived GagL85 93. In contrast, immunization with a DNA plasmid expressing Leader-Gag protein led to the induction of GagL85-93-specific CD8+ T cell responses. A second immunization study demonstrated that this induction of GagL85-93-specific CD8+ T cells was abrogated if the DNA plasmid encoding GagL85-93 also expressed the adenovirus epitopes Hexon486-494 and DBP418-426. These results suggested that adenoviral CD8+ T cell epitopes may have an inhibitory effect on the induction of transgene-specific CD8+ T cells, and it is this hypothesis which is explored in this thesis. We were able to demonstrate that while the presence of H 2Db-restricted DBP418-426 did not have an effect on the induction of GagL85-93-specific CD8+ T cells, the GagL85 93(H-2Db) response was dominated by that of the H 2Dd-restricted Hexon486 494 epitope. However, no Hexon486-494-dependent suppression of GagL85 93-specific CD8+ T cells was observed in H2-Db/b mice, suggesting that competition is occurring on the level of the responding CD8+ T cells. Co-immunization with either IL2- or IL23-encoding DNA plasmids was able to partially restore induction of GagL85 93-specific CD8+ T cells in the presence of Hexon486 494. In contrast, neither co-immunization with IL2- or IL23-encoding Ad5 vectors, nor immunization of H2-Db/b mice with Ad5.Leader-Gag led to induction of GagL85-93-specific CD8+ T cell responses. This difference was attributed to the presence of other dominant Ad5-derived epitopes in the vector, which were verified by ELISpot assay. When less immunogenic OVA-derived epitopes Y3, Q4 and T4 were employed, enhanced induction of vector-specific CD8+ T cell responses following immunization was also observed. In addition to interference by vector-induced immune responses, the efficacy of Ad5 vectors is greatly impaired by widespread pre-existing immunity against Ad5. This phenomenon can be observed by the complete lack of a GagL85 93-specific CD8+ T cell response to immunization with Ad5.TxnGagL in Ad5-pre-immune mice. However, increased binding antibody titers have also been reported in experiments using Ad5-pre-immune mice, contradicting the suggestion of vector neutralization and indicating possible ongoing transgene expression. Work presented here demonstrates that adoptive transfer of CD4+ or CD8+ T cells from Ad5-pre-immune mice showed no inhibitory effect on the induction of GagL85 93-specific CD8+ T cells, whereas GagL85 93-specific CD8+ T cell responses were abrogated after transfer of Ad5-pre-immune plasma. Adoptive transfer of Ad5-binding antibodies did not have a detectable effect on the induction of CD8+ T cells, therefore suggesting a role for Ad5-binding antibodies in enhancement of transgene-specific antibody titers in Ad5 pre-immune mice. Based on phylogenetic differences between rare adenovirus types and Ad5 it is commonly assumed that vectors based on rare types are not subject to Ad5-specific immune responses. We therefore characterized and evaluated vectors based on adenovirus 48 and 50 and compared them to Ad5. Vectors based on both types were less immunogenic than Ad5 in most experiments and failed to induce transgene-specific CD8+ T cell responses. Only immunization with Ad48.Leader-GagC1K or Ad50.Env resulted in protective immune responses comparable to those induced by Ad5, which were dependent on the induction of CD4+T helper cells and humoral immune responses. Both, Ad48 and Ad50, induced vector-specific neutralizing antibodies which were cross-reactive against each other. Interestingly, vectors based on Ad48 were not influenced by pre-existing immunity against Ad5, whereas efficacy of Ad50-based vectors was impaired in Ad5-pre-immune mice to a similar extent as with Ad5 itself. The work presented here further elucidates the influence of vector-induced immunity on vaccine responses, as well as the effect of pre-existing immunity against Ad5 on adenovirus-based immunization. These results highlight the importance of thorough immunogen and vector characterization during the development of vaccine regimens targeted for use in humans.

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Hrycak, Camilla Patrizia: Einfluss adenovirus-spezifischer Immunantworten auf die Immunisierung mit adenovirus-basierten Vektoren. 2019.

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