Untersuchung der Rollen von STAT3 und p47 in Toll like Rezeptor vermittelten Signalwegen

Sigmund, Anna Magdalena GND

Das angeborene Immunsystem vermittelt die Erkennung eindringender Pathogene über spezifische Mustererkennungsrezeptoren (PRRs). Toll like Rezeptoren (TLRs), eine Familie der PRRs, erkennen Pathogen assoziierte molekulare Muster (PAMPs) an der Zytoplasma- bzw. endolysosomalen Membran und übertragen das Signal „spezifische Infektion“ ins Zellinnere. Die beiden zentralen Adapterproteine MyD88 und TRIF vermitteln die TLR Signalweiterleitung, die unter anderem zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und der Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren, wie z.B. Zytokinen und Effektormolekülen, wie z.B. reaktive Sauerstoffspezies (ROS), führt. Die zytoplasmatisch lokalisierten Proteine p47phox und STAT (signal transducer and activator of transcription) 3 binden - von uns erhobenen Befunden zufolge - an die intrazellulären Domänen aktivierter TLRs. Die in meiner Arbeit dargelegten Daten zeigen eine ligandenabhängige direkte Interaktion von TLR2 und -4 mit p47phox, einer Untereinheit phagozytären NADPH-Oxidase (NOX)2. NOX2 ist ein Multienzymkomplex, der auf Rezeptor Aktivierung hin die Produktion von ROS induziert. Die regulatorische Komponente p47phox wird im Laufe der Aktivierung an multiplen Serinen phosphoryliert. Dabei wird zwischen zur Aktivität essentiellen und lediglich verstärkenden, sogenannten Priming-Phosphorylierungen unterschieden. Hitze-inaktivierte Bakterien induzierten im Gegensatz zu TLR Liganden eine Priming-Phosphorylierung am Serin 345. TLR-Stimulation resultierte allerdings, auch ohne vorherige Priming-Phosphorylierung, in einer durch die phagozytäre NADPH-Oxidase induzierten ROS-Produktion. Meine Daten unterstützen ein Modell, in dem p47phox nach TLR-Aktivierung direkt an den TLR rekrutiert wird, um dort durch die über MyD88/TRIF aktivierte ERK1/2 und eventuell auch durch IRAK4 phosphoryliert zu werden. Die Phosphorylierung/en löst/lösen die Dissoziation vom Rezeptor, die Translokation zur phagosomalen Membran, die Vervollständigung der NADPH-Oxidase und damit die Aktivierung des Komplexes aus. Demnach wird der an der Membran durch TLRs induzierte Signalweg zur Assemblierung des aktiven NADPH-Oxidase Komplexes durch die TLR-p47phox Interaktion vermittelt. Der Transkriptionsfaktor STAT3 vermittelt Signale auf direkte Bindung an Oberflächenrezeptoren, wie z.B. Zytokinrezeptoren. Nach seiner Aktivierung transloziert STAT3 in den Zellkern, um dort die Expression spezifischer Gene zu regulieren. Die STAT3 Aktivierung erfolgt über die Phosphorylierung am Tyrosin 705 durch z.B. rezeptorgebundene Tyrosin-Kinasen der JAK-Familie. Eine zusätzliche Phosphorylierung am Serin 727 gilt lediglich als STAT3-Signal verstärkend. Eine Involvierung von STAT3 in TLR vermittelte Signalwege ist nicht geklärt. Im zweiten Teil der Arbeit identifizierte ich ERK1/2 als TLR induzierte STAT3 Serin-Kinase. Des Weiteren demonstrierte ich die Essentialität der Phosphorylierung am Tyrosin 705 in Bezug auf die Kerntranslokation und die anschließende Aktivierung der Genexpression, insbesondere der von plasminogen aktivator inhibitor- (Pai) 2. Diese Phosphorylierung wurde durch einen TLR eingeleiteten, sekundären Loop am IL-10 Rezeptor durch JAK1 induziert und resultierte in der umgehenden Translokation in den Zellkern. Obwohl die Phosphorylierung am Serin 727 keinen Einfluss auf die Kerntranslokation hatte, induzierte nur Tyrosin- UND Serin-phosphoryliertes STAT3 auf TLR-Stimulation hin die Expression von Pai-2. Meine Daten zeigen - unseres Wissens nach - zum ersten Mal eine Abhängigkeit von der Serin-Phosphorylierung in der STAT3 vermittelten Genexpression. Die in meiner Arbeit dargestellten Ergebnisse bieten neue Einblicke in die Signalweiterleitung von TLRs zur ROS Produktion auf der einen Seite und in die STAT3 abhängige Pai-2 Expression auf der anderen Seite.

The innate immune system mediates the recognition of invading pathogens by specific pattern recognition receptors (PRRs). Toll like receptors are one family of PRRs that recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) above the cytoplasmic- and endolysosomal membrane and transmit the signal “specific infection” into the cytoplasm. The two adapter molecules MyD88 and TRIF largely mediate the TLR downstream signal transduction, leading to e.g. transcription factor activation, the release of inflammatory mediators such as cytokines, and effector molecules such as reactive oxygen species (ROS). According to our previous results, cytoplasmic p47phox and STAT (signal transducer and activator of transcription) 3 bind to the intracellular domain of activated TLRs. The presented data describe a ligand-dependent interaction of p47phox with TLR2 and -4. P47phox is a subunit of the multi enzyme complex NADPH oxidase (NOX2) that induces ROS production upon receptor activation. During activation the regulatory compound p47phox is phosphorylated at multiple serines. It is important to differentiate between priming phosphorylations that only boost the ROS production, and those that are essential for the activation. In contrast to TLR ligands, heat inactivated bacteria induced the priming phosphorylation on serin 345. However, TLR stimulation was followed by NOX2 mediated ROS production without prior priming phosphorylation. According to my results upon stimulation, p47phox is recruited to the TLR and phosphorylated by ERK1/2 and maybe also IRAK4 in a MyD88/TRIF dependent manner. Phosphorylation leads to dissociation from the receptor and translocation to the phagosomal membrane. Upon completion of the complex, NOX2 is activated and produces superoxide anion. Therefore, the interaction between the TLR and p47phox triggers the signaling from the membranous TLR to the assembly of the active NADPH-oxidase complex. The transcription factor STAT3 mediates signals via direct binding to surface receptors such as cytokine receptors. Upon activation, STAT3 translocates to the nucleus to induce the expression of specific genes. STAT3 is activated by phosphorylation on its tyrosin 705 via receptor-associated tyrosin kinases of the JAK family. Additional phosphorylation on the serin 727 is thought to enhance the STAT3 signal. Involvement of STAT3 in TLR-mediated signalling is poorly understood. In the second part of my work, I identified ERK1/2 as TLR-induced STAT3 serin kinase. Furthermore, I demonstrated the essentiality of the tyrosin phosphorylation for nuclear translocation and subsequent gene expression especially of the plasminogen aktivator inhibitor- (Pai) 2. This phosphorylation was induced by a TLR mediated secondary loop at the IL-10 receptor by JAK1. It resulted in the immediate translocation to the nucleus. The phosphorylation on the serin 727 had no effect on the nuclear translocation. Nevertheless, only tyrosin and serin phosphorylated STAT3 induced the expression of Pai-2 upon TLR stimulation. My data illustrate, to our knowledge for the first time, a dependence of STAT3 mediated gene expression on its serin phosphorylation. The results presented in my thesis provide new insights into signal transduction from TLRs to ROS production and to STAT3 dependent Pai-2 expression.

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Sigmund, A.M., 2019. Untersuchung der Rollen von STAT3 und p47 in Toll like Rezeptor vermittelten Signalwegen. https://doi.org/10.17185/duepublico/37002
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