Identifizierung neuer Genprodukte mit einem Einfluss auf humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Jansen, Soeren

Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind in der Lage, Vorläuferzellen hervorzubringen, die in spezialisierte Zellen differenzieren können. Die Mechanismen, welche die Selbsterneuerung versus Differenzierung steuern, sind bis heute weitgehend unbekannt. Mit dem Ziel, neue Gene zu identifizieren, deren Genprodukte an den Prozessen der Selbsterneuerung und Differenzierung von primitiven humanen Hämatopoetischen Stammzellen beteiligt sind, wurden im Vorfeld dieser Arbeit Genexpressionsanalysen von unterschiedlichen hämatopoetischen Zellpopulationen angefertigt. Es konnten Gene identifiziert werden, die spezifisch in primitiven hämatopoetischen Zellfraktionen exprimiert werden. In dieser Arbeit wurde der Einfluss ausgewählter Gene auf die Dynamik von CD34+ und CD133+ Populationen in HSZ untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Kandidatengene in lentivirale Plasmide kloniert und stabil in frisch isolierten CD34+ Zellen überexprimiert. Im weiteren Verlauf wurden die Anteile der CD34+ und CD133+ Populationen durchflusszytometrisch über 14 Tage dokumentiert. Es konnten 8 Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die nach ihrer Überexpression die Populationskinetik im Vergleich zu den Kontrollen veränderten. Hierzu gehören die Gene BHLHB2, CEBPD, KLF4, SNAI2, SOX2, SOX9, SOX11 und ZNF281. Zellschicksalsanalysen von Nachkommen einzelner primitiver HSZ deuten darauf hin, dass die Entscheidung der Selbsterneuerung versus Differenzierung möglicherweise durch asymmetrische Zellteilungen reguliert wird. Es wurden bislang vier Proteine identifizieren, die in ca. 20% sich teilender humaner HSZ asymmetrisch segregieren. Zwei dieser Proteine, CD53 und CD63, gehören zur Familie der Tetraspanine. In dieser Arbeit wurde nach Möglichkeiten gesucht, solche asymmetrischen Zellteilungen in lebenden Zellen verfolgen zu können. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Tetraspanin-eGFP Fusionsproteine generiert und durchflusszytometrisch, proteinbiochemisch sowie immunzytochemisch validiert. Es stellte sich heraus, dass CD63-eGFP Fusionsproteine sich am besten zur optischen Nachverfolgung asymmetrischer Zellteilungen von CD34+ Zellen eignen. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Überexpression von CD9-, CD81-, CD82- und CD151-eGFP Fusionsproteinen zur Bildung von atypischen Vesikeln führte. CD37a-, CD81- und CD151-eGFP Fusionsproteine kolokalisierten sowohl mit dem frühen, als auch mit dem späten endosomalen Kompartiment.

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Jansen, Soeren: Identifizierung neuer Genprodukte mit einem Einfluss auf humane hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen. 2014.

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