Astrozyten-vermittelte Glutamat-Toxizität bei der Spinalen Muskelatrophie
Die spinale Muskelatrophie ist eine fortschreitende neuromuskuläre Erkrankung, die durch den Verlust des SMN1verursacht wird, was zu einem Verlust an spinalen MN und damit zu Muskelschwäche und Muskelschwund führt. Die Pathogenese des MN-Verlusts bei der SMA und die selektive Anfälligkeit verschiedener Zellpopulationen sind noch nicht vollständig geklärt.
Um die Rolle der spinalen Astrozyten in der Pathogenese der milden und spät einsetzenden SMA zu untersuchen, wurde neben in vitro-Ansätzen auch ein entsprechendes Mausmodell verwendet. Es wurden Immunfärbungen (immunhisto- immunzytochemische Färbungen), Western-Blot-Analysen, siRNA-Transfektionen, Glutamat Assays, ELISA, Verhaltenstests und elektrophysiologische Messungen durchgeführt.
Eine frühe Aktivierung der spinalen Astrozyten und eine Verringerung des EAAT1-Kanals an P20 gingen dem Verlust der spinalen MN bei SMA-Mäusen voraus, der am P42 eintrat. Die EAAT1-Reduktion führte zu erhöhten Glutamat-Level im RM von SMA-Mäusen bei P20 und P42. SMA-ähnliche Astrozyten, die mittels siRNA erzeugt wurden, und ein ex-vivo-Modell der Glutamat-Toxizität mit OTR-Kulturen zeigten die kritische Rolle der Glutamat-Homöostase bei der Degeneration der MN. Die präventive Verabreichung von AA, einem Inhibitor der Astrozyten-Aktivierung, schützt bei SMA-Mäusen vor dem Verlust der MN (P28) und führte zu erhöhten EAAT1-Proteinspiegeln im Vergleich zu SMA-Mäusen, die mit dem Vehikel behandelt wurden. Zusätzlich konnte der bereits bestehende Anstieg von Glutamat im RM wieder auf Kontroll-Level zurück gebracht werden. Darüber hinaus bewahrte AA die motorischen Funktionen bei Verhaltensexperimenten, die elektrophysiologischen Eigenschaften und die Muskelveränderungen von SMA-Mäusen.
In einem translationalen Ansatz wurden aus humanen Fibroblasten induzierte Astrozyten kultiviert und mittels SMN1 siRNA eine transfiziert, was zu einer verminderten EAAT1-Expression und einer reduzierten Aufnahme und einer erhöhten Glutamat-Freisetzung führte. Diese Ergebnisse wurden durch den Nachweis erhöhter Glutamat-Level und verringerter EAAT1-Spiegel im Liquor von unbehandelten SMA-Patienten des Typs 2 und 3 bestätigt. Darüber hinaus war Glutamat in Serumproben erhöht, während EAAT1 nicht nachweisbar war.
Die Daten belegen die entscheidende Rolle der spinalen Astrozyten in der Pathogenese der spät einsetzenden SMA, die eine potenzielle treibende Kraft für den MN-Verlust durch Glutamat-Exzitotoxizität aufgrund der EAAT1-Reduktion als frühes pathophysiologisches Ereignis darstellt. Darüber hinaus stellt unsere Studie EAAT1 als potenzielles therapeutisches Ziel für zusätzliche SMN-unabhängige Therapiestrategien als Ergänzung zu SMN-verstärkenden Medikamenten vor.
Spinal muscular atrophy (SMA) is a hereditary progressive neuromuscular disorder resulting in the loss of spinal motor neurons (MN) and leading to muscle weakness and wasting and is caused by a loss of the survival of motor neuron 1 (SMN1) gene. The pathogenesis of MN loss in SMA and the selective vulnerability in different cellular populations such as MN are not fully understood.
To investigate the role of spinal astrocytes in the pathogenesis of late-onset SMA, a mouse model in addition to in vitroapproaches was used. Immunostaining, Western blot analysis, small interfering ribonucleic acid (siRNA) transfections, functional assays, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), behavioural tests, and electrophysiological measurements were performed.
Early activation of spinal astrocytes and a reduction of the excitatory amino acid transporter 1 (EAAT1) on P20 preceded the loss of spinal MN in SMA mice occurring on P42. EAAT1 reduction resulted in elevated glutamate levels in the spinal cord of SMA mice at P20 and P42. In a cell culture model of SMN-deficient astrocytes generated by siRNA and an ex vivo cell culture model of organotypic spinal cord slices, glutamate homeostasis could be revealed as a critical role in the degeneration of MN.
The pre-emptive administration (P28) of Arundic Acid (AA), as an inhibitor of astrocyte activation, to SMA mice prior to the loss of MN resulted in elevated EAAT1 protein levels compared to vehicle treated SMA mice, prevented the increase of glutamate in the spinal cord and the loss of spinal MN. Additionally, AA preserved motor functions during behavioural experiments, the electrophysiological properties, and muscle alteration of SMA mice.
Healthy human fibroblasts were induced into astrocytes and transfected with SMN1 siRNA, resulting in reduced EAAT1 expression, increased glutamate release and reduced glutamate uptake. Furthermore, elevated glutamate levels and reduced levels of EAAT1 were detected in cerebrospinal fluid of untreated SMA type 2 and 3 patients. In addition, glutamate was elevated in serum samples while EAAT1 was not detectable.
The data give evidence for the crucial role of spinal astrocytes in the pathogenesis of late-onset SMA and a potential driving force for MN loss by glutamate excitotoxicity caused by EAAT1 reduction as an early pathophysiological event. Furthermore, the study introduces EAAT1 as a potential therapeutic target for additional SMN-independent therapy strategies to complement SMN-enhancing drugs.