IFNα-Subtyp-spezifische Suszeptibilität von HBV und SARS-CoV-2 im Laufe der Infektion

IFNα-Subtypen stellen eine wichtige Komponente des angeborenen Immunsystems in der Abwehr gegen Pathogene wie Bakterien, Pilzen und Viren dar. Die Induktion von IFNα findet nach Erkennung von hochkonservierten Strukturen der Pathogene durch bestimmte Sensoren statt und versetzt Zellen in einen antiviralen Zustand. Dabei führt die Bindung von IFNα an dessen Rezeptor zur Expression hunderter ISGs, die über zahlreiche Mechanismen direkt antiviral wirken. Bekannt ist jedoch, dass die zwölf humanen IFNα-Subtypen abhängig von verschiedenen Virusinfektion unterschiedliche antivirale Effekte aufweisen. Der Grund für diese Unterschiede konnte noch nicht vollständig geklärt werden. In dieser Arbeit wurden Typ-I-IFN-Induktion, der antivirale Effekt der IFNα-Subtypen sowie die Modulation des antiviralen Effekts durch andere Zytokine oder Mutation von IFNα2 für HBV und SARS-CoV-2 untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit HBV sowohl in einer Zelllinie als auch in Primärzellen zu keiner Induktion von Typ-I-IFN geführt hat. Für SARS-CoV-2 hingegen konnte in Calu-3 Zellen eine späte Typ-I-IFN-Produktion gemessen werden, die abhängig von der Replikationskompetenz des Virus ist.
Für die antiviralen Effekte der IFNα-Subtypen konnten für beide Viren signifikante Unterschiede festgestellt werden und die IFNα-Subtypen ließen sich jeweils in stark, mittel und schwach antivirale Subtypen eingruppieren. In beiden Infektionen zeigte IFNα5 den stärksten antiviralen Effekt, was sich von bereits publizierten Ergebnissen für andere Virusinfektionen wie HIV oder Influenza unterscheidet. Dies macht deutlich, dass die Effekte der IFNα-Subtypen virusspezifisch sind. Die antiviralen Effekte korrelierten zudem weitestgehend mit der Expression von bestimmten Schlüssel-ISGs.
Im Falle von HBV konnte gezeigt werden, dass die APOBEC3-Gene nach IFNα-Stimulation in HepaRG Zellen relativ schwach induziert wurden, wobei signifikante Induktionen nur für APOBE3F und APOBEC3G erzielt werden konnten. Auch hier wurden Subtyp-spezifische Unterschiede beobachtet. Eine Veränderung der Expression durch eine HBV-Infektion konnte nicht beobachtet werden.
Mögliche Schlüssel-Moleküle für den antiviralen Effekt gegen SARS-CoV-2 wurden in Primärzellen mittels Transkriptom- und Proteomanalyse analysiert. Es konnten wiederum deutliche Unterschiede zwischen den Subtypen beobachtet werden, die ein Beleg für die spezifischen Aktivitäten sind. Die Expressionsdaten der ISGs spiegelten im Transkriptom die antiviralen Aktivitäten der Subtypen wider und es fanden sich 19 Gene, die durch alle Subtypen differentiell reguliert wurden. Innerhalb dieser 19 Gene zeigte die Expression von MX1 und OAS2 eine deutliche Korrelation mit den antiviralen Effekten. Ebendiese beiden Gene konnten auch im Proteom als stark on-off-reguliert identifiziert werden, wiederum in Korrelation mit den antiviralen Effekten. Zusätzlich zeigten die Proteomdaten, dass die Infektion mit SARS-CoV-2 zu einer verringerten Abundanz von Mucinen führt, die wichtig für den Schutz des respiratorischen Trakts sind.
Die Kombinationstherapie von IFNα2 und IFNα5 mit Remdesivir gegen SARS-CoV-2 führte in Vero E6 Zellen zu einem verbesserten antiviralen Effekt auf additive Weise. Für ausgewählte Konzentrationen konnte dies auch in humanen Lungenprimärzellen beobachtet werden. Dies gibt Einblicke in die Möglichkeit einer neuen alternativen Therapie.
Eine kombinierte Stimulation mit dem proinflammatorischen Zytokin IL-1β, dass die Aktivierung von STATs begünstigen soll, führte im Falle der HBV-Infektion zu einem verminderten antiviralen Effekt. Für SARS-CoV-2 konnte die leichte Tendenz eines verbesserten antiviralen Effekts beobachtet werden, der sich jedoch nur auf die Stimulation von schwach antiviralen Subtypen in niedrigen Konzentrationen beschränkte. Eine Untersuchung der ISG-Induktion zeigte von drei untersuchten ISGs lediglich eine signifikante Erhöhung von ISG20 nach der Kostimulation mit IFNα5 oder IFNα7 und IL-1β in Vero E6 Zellen, was auf eine gewisse Zelltyp- und ISG-Spezifizität des kombinatorischen Effekts von IL-1β hindeutet.
Die Generation und Verwendung von IFNα2-Mutanten basierend auf den Sequenzunterschieden zu IFNα6 und IFNα14 zeigte für beide Virusinfektionen eine Verbesserung des Effekts gegenüber IFNα2 durch IFNα2/IFNα14-Mutanten, die Mutationen für die Bindungsstellen an die IFNAR-Untereinheiten enthielten. Besonders die Mutation der IFNAR1-Bindestellen führte zu einem signifikant verbesserten Effekt.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass sich die Induktion von Typ-I-IFN zwischen verschiedenen Virusinfektionen unterscheidet. Gleiches gilt auch für die antiviralen Effekte, die Subtyp-spezifische Aktivitäten erkennen lassen. Diese Hypothese konnte auch auf mRNA- und Protein-Ebene durch die Analyse von Transkriptom- und Proteomdaten bestätigt werden. Außerdem liefert die Arbeit neue Ansatzpunkte für die Verbesserung des antiviralen Effekts, sei es durch Kombination mit DAAs, anderen Zytokinen oder durch die Generation neuer IFNα2-Mutanten.

IFNα subtypes represent an important effector cytokine of the innate immune system in defending pathogens like bacteria, fungi or viruses. IFNα is induced upon recognition of highly conserved structures of the pathogens by specific sensors and it triggers an antiviral state within cells. Autocrine and paracrine binding of IFNα to its receptors results in the expression of hundreds of ISGs, which act directly antiviral through various mechanisms. It is known that the twelve human IFNα subtypes exhibit unique antiviral effects during different viral infections. The exact molecular mechanisms for these differences have not yet been elucidated so far. In this thesis, type I IFN induction, the antiviral effect of the IFNα subtypes and the modulation of this antiviral effect by other cytokines or mutations of IFNα2 was investigated for HBV and SARS-CoV-2.
The experiments showed that the infection with HBV led to no type I IFN induction, neither in a cell line nor in primary cells. However, for SARS-CoV-2 a late type I IFN response could be measured in Calu-3 cells which was dependent on viral replication.
For the antiviral effects of the IFNα subtypes, significant differences could be observed for both infections. The different IFNα subtypes could be divided into three groups based on their high, medium or low antiviral effect. In both infections, IFNα5 showed the strongest antiviral effects, which differed from the results published for other viruses like HIV or IAV. This emphasizes that the effect of the IFNα subtypes is virus-specific. For most parts, the antiviral effects correlated with the expression of some key ISGs.
In the case of HBV, APOBEC3 gene levels were relatively low after IFNα stimulation of differentiated HepaRG cells. Significant induction could only be observed for APOBEC3F and APOBEC3G. Again, subtype-specific differences were observed. Changes in the expression could not be measured during an established HBV infection.
Possible key molecules for the antiviral effect against SARS-CoV-2 were examined in primary cells by transcriptomics and proteomics analysis. Once more, clear differences among the subtypes could be observed, which might explain their specific antiviral activities. The ISG expression data reflected the antiviral activities of the subtypes in the transcriptome. There were 19 genes, which were differentially regulated by all subtypes. Within this set of genes, the expression of MX1 and OAS2 showed an obvious correlation with their antiviral effects. Both genes could also be identified as strongly on-off regulated proteins in the proteomic analysis, once again in correlation with their antiviral effects. Further, the protein data revealed that the infection with SARS-CoV-2 led to a reduced abundance of mucins, which are important for the protection of the respiratory tract.
Combination therapy of IFNα2 or IFNα5 with remdesivir against SARS-CoV-2 in Vero E6 cells led to an increased antiviral effect in an additive manner. For selected concentrations, this could also be validated in human primary lung cells. This might contribute to new insight for alternative therapies.
A combined stimulation with the pro-inflammatory cytokine IL-1β, which was reported to increase STAT activation, led to the reduction of the antiviral effect of IFNα subtypes in the case of HBV. For SARS-CoV-2, there was a slight tendency that IL-1β might increase the antiviral effect. However, this was limited to the low antiviral subtypes in low concentrations. An analysis of the ISG induction revealed that out of three examined ISGs, there was only a significantly increased induction observed for ISG20 after co-stimulation of IFNα5 or IFNα7 with IL-1β in Vero E6 cells. This might point at a certain cell- and/or ISG-specificity of the combinatory effect of IL-1β.
The generation and stimulation with IFNα2 mutants based on the amino acid differences with IFNα6 and IFNα14 showed an increased antiviral activity compared to IFNα2 by IFNα2/IFNα14 mutants, which contained mutations for the IFNAR binding sites. Especially, mutations of the IFNAR1 binding site led to significantly increased effects.
In summary, it was shown in this thesis that the induction of type I IFNs differs between different virus infections. Same applies to the antiviral effects, which elucidate subtype-specific activities and a clear separation of IFNα subtypes in groups with high, medium and low antiviral activity. This hypothesis could also be confirmed on mRNA and protein levels by transcriptomics and proteomics. Further, this thesis points at new central aspects for the enhancement of the antiviral effects, which might be combination with DAAs, combination with other cytokines or by generation of new IFNα2 mutants.

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