Biochemical and genetic analysis of Dam1c ring assembly at the budding yeast kinetochore
During mitotic cell division, chromosomes containing the genetic information of an organism must be equally and accurately distributed to the two new cells. Chromosomes attach to dynamic microtubules of the mitotic spindle and are pulled apart harnessing forces generated by microtubule depolymerization and spindle elongation. Microtubules bind to a well-defined proteinaceous structure, the kinetochore, which is specifically assembled on centromeric chromatin of each chromosome. Besides forming microtubule attachments, kinetochores perform additional functions such as sensing the attachment status of each chromosome and initiating spindle assembly checkpoint signaling. An essential component of the Saccharomyces cerevisiae kinetochore is the Dam1 complex (Dam1c). The ten-subunit complex has the propensity to oligomerize into rings with a 16-fold symmetry that encircle microtubules and track their dynamic plus ends. Together with the Ndc80 complex (Ndc80c), which serves as a kinetochore receptor for Dam1c, Dam1c provides the physical link between the kinetochore and spindle microtubules and eventually translates microtubule depolymerization into chromosome movement.
Even though many features of the Dam1 complex have been investigated during the past two decades, employing genetic, cell biological, biochemical, biophysical and structural biological approaches, it is still poorly understood how the complex is specifically recruited to the plus ends of kinetochore microtubules. Furthermore, relatively little is known about interactions of the complex with other proteins such as microtubule-associated proteins (MAPs).
In the present study, the interaction between Dam1c with the autonomous plus end-tracking protein Bim1/EB1 is characterized using a combination of genetics, cell biology and biochemical reconstitution. Furthermore, insights into the structure of the Dam1c-Bim1 complex have been obtained by negative stain electron microscopy and chemical crosslinking. It is demonstrated that Bim1 closely associates with the protrusion domains of the Dam1 complex by binding a conserved SxIP motif located in the C-terminus of the Duo1 subunit. Binding of Bim1 to the complex is required for maximum loading of Dam1c onto kinetochores in metaphase and ensures timely mitotic progression. Phosphorylation by the conserved kinase Mps1 promotes the interaction between Dam1c and Bim1 and overexpression of Mps1 affects the localization of Dam1c during metaphase. In contrast, binding of Bim1 to Dam1c is refractory to phosphorylation by Ipl1/Aurora B. Biochemical and structural analyses reveal that Bim1 induces oligomerization of Dam1c into partially assembled rings with well-defined curvature. Furthermore, Bim1 recruits Bik1/CLIP-170 to Dam1c and by this induces the assembly of Dam1c into complete rings even in the absence of microtubules. Hence, binding of Bim1 and subsequent recruitment of Bik1/CLIP-170 is a novel regulatory mechanism for Dam1c ring assembly. Simultaneous disruption of Bim1-binding to Dam1c and interfering with Cdk1- and Ipl1/Aurora B-regulated Dam1c oligomerization mechanisms is detrimental to viability of yeast cells and negatively affects growth especially at low temperatures, suggesting that oligomerization of Dam1c is essential for formation of mature kinetochore-microtubule attachments.
Dam1c finally engages with the Ndc80 complex to form load-bearing kinetochore-microtubule attachments. Biochemical reconstitution assays suggest that Dam1c engages either with Bim1-Bik1 or with Ndc80c. This implies that the Dam1c-Bim1-Bik1 and Dam1c-Ndc80c complexes presumably represent two distinct biochemical entities of Dam1c that might exist at different timepoints during the formation of kinetochore-microtubule attachments.
These results demonstrate that binding of Bim1 to Dam1c is an important step in the regulation of outer kinetochore assembly and serves to control oligomerization and kinetochore recruitment of the complex. Kinetochore-localized Mps1 activity promotes binding of Bim1 and ensures specific accumulation of Dam1c in proximity of unattached kinetochores, but not at any other part of the mitotic spindle such as the midzone. Furthermore, Bim1 might serve as temporary placeholder that initially brings Dam1c to the microtubule plus end and is subsequently replaced by the Ndc80 complex to form mature end-on attachments. Previous reports about physical interactions between the metazoan Ska complex, the functional homolog of Dam1c, and the end-binding protein EB1 suggest that the mechanistic principles described in this thesis may be more widely conserved among eukaryotes.
Even though many features of the Dam1 complex have been investigated during the past two decades, employing genetic, cell biological, biochemical, biophysical and structural biological approaches, it is still poorly understood how the complex is specifically recruited to the plus ends of kinetochore microtubules. Furthermore, relatively little is known about interactions of the complex with other proteins such as microtubule-associated proteins (MAPs).
In the present study, the interaction between Dam1c with the autonomous plus end-tracking protein Bim1/EB1 is characterized using a combination of genetics, cell biology and biochemical reconstitution. Furthermore, insights into the structure of the Dam1c-Bim1 complex have been obtained by negative stain electron microscopy and chemical crosslinking. It is demonstrated that Bim1 closely associates with the protrusion domains of the Dam1 complex by binding a conserved SxIP motif located in the C-terminus of the Duo1 subunit. Binding of Bim1 to the complex is required for maximum loading of Dam1c onto kinetochores in metaphase and ensures timely mitotic progression. Phosphorylation by the conserved kinase Mps1 promotes the interaction between Dam1c and Bim1 and overexpression of Mps1 affects the localization of Dam1c during metaphase. In contrast, binding of Bim1 to Dam1c is refractory to phosphorylation by Ipl1/Aurora B. Biochemical and structural analyses reveal that Bim1 induces oligomerization of Dam1c into partially assembled rings with well-defined curvature. Furthermore, Bim1 recruits Bik1/CLIP-170 to Dam1c and by this induces the assembly of Dam1c into complete rings even in the absence of microtubules. Hence, binding of Bim1 and subsequent recruitment of Bik1/CLIP-170 is a novel regulatory mechanism for Dam1c ring assembly. Simultaneous disruption of Bim1-binding to Dam1c and interfering with Cdk1- and Ipl1/Aurora B-regulated Dam1c oligomerization mechanisms is detrimental to viability of yeast cells and negatively affects growth especially at low temperatures, suggesting that oligomerization of Dam1c is essential for formation of mature kinetochore-microtubule attachments.
Dam1c finally engages with the Ndc80 complex to form load-bearing kinetochore-microtubule attachments. Biochemical reconstitution assays suggest that Dam1c engages either with Bim1-Bik1 or with Ndc80c. This implies that the Dam1c-Bim1-Bik1 and Dam1c-Ndc80c complexes presumably represent two distinct biochemical entities of Dam1c that might exist at different timepoints during the formation of kinetochore-microtubule attachments.
These results demonstrate that binding of Bim1 to Dam1c is an important step in the regulation of outer kinetochore assembly and serves to control oligomerization and kinetochore recruitment of the complex. Kinetochore-localized Mps1 activity promotes binding of Bim1 and ensures specific accumulation of Dam1c in proximity of unattached kinetochores, but not at any other part of the mitotic spindle such as the midzone. Furthermore, Bim1 might serve as temporary placeholder that initially brings Dam1c to the microtubule plus end and is subsequently replaced by the Ndc80 complex to form mature end-on attachments. Previous reports about physical interactions between the metazoan Ska complex, the functional homolog of Dam1c, and the end-binding protein EB1 suggest that the mechanistic principles described in this thesis may be more widely conserved among eukaryotes.
Während der mitotischen Zellteilung müssen Chromosomen, die die genetische Information eines Organismus tragen, gleichmäßig und mit hoher Präzision auf die beiden neu entstehenden Zellen verteilt werden. Hierzu binden Chromosomen an Mikrotubuli der mitotischen Spindel und werden unter Nutzung der Kräfte, die aus der Depolymerisation und Verlängerung der Spindel resultieren, voneinander getrennt. Dabei binden Mikrotubuli an eine bestimmte Proteinstruktur, die Kinetochor genannt wird und spezifisch an den Zentromeren eines jeden Chromosoms gebildet wird. Neben der Bindung an Mikrotubuli erfüllen Kinetochore weitere wichtige Funktionen wie die qualitative Überprüfung der Kinetochor-Mikrotubulus-Interaktion und die Initialisierung der Signalkaskade des mitotischen Checkpoints. Ein essenzieller Bestandteil der Kinetochors der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Dam1 Komplex (Dam1c). Dieser aus zehn Untereinheiten bestehende Komplex besitzt die Fähigkeit, sich aus 16 einzelnen Komplexen symmetrisch zu einem Ring zusammenzusetzen, der einen Mikrotubulus umschließen und prozessiv an dessen dynamisches Ende binden kann. Zusammen mit dem Ndc80 Komplex (Ndc80c), der am Kinetochor als Rezeptor für den Dam1 Komplex fungiert, stellt der Dam1 Komplex die physische Verbindung zwischen dem Kinetochor und den Mikrotubuli der mitotischen Spindel dar, die letztlich die Mikrotubuli-Depolymerisation in den Transport der Chromosomen umsetzt.
Obwohl zahlreiche Eigenschaften des Dam1 Komplexes in den vergangenen zwei Jahrzehnten mittels genetischer, zellbiologischer, biochemischer, biophysikalischer und strukturbiologischer Ansätze erforscht wurden, ist bis heute wenig darüber bekannt, wie der Komplex selektiv an das Plus-Ende der Kinetochor-Mikrotubuli gelangt. Des Weiteren sind physische Interaktionen des Komplexes mit anderen Proteinen, wie Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs), wenig erforscht.
In der vorliegenden Studie wird die Interaktion des Dam1 Komplexes mit dem autonomen Plus-Ende-bindenden Protein Bim1/EB1 mittels einer Kombination aus genetischen, zellbiologischen und biochemischen Methoden untersucht. Zusätzliche liefern elektronenmikroskopische Daten nach Negativkontrastierung und chemisches Crosslinking Einblicke in die Struktur des Dam1c-Bim1 Komplexes. Bim1 lagert sich in der Nähe der sogenannten Protrusion-Domäne an den Dam1 Komplex an, indem es eine konservierte SxIP-Sequenz im C-Terminus der Untereinheit Duo1 bindet. Die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex wird für eine vollständige Rekrutierung des Komplexes an das Kinetochor während der Metaphase und den korrekten zeitlichen Verlauf der Mitose benötigt. Phosphorylierung durch die konservierte Kinase Mps1 verstärkt die Interaktion zwischen Dam1c und Bim1 und Überexpression von Mps1 beeinträchtigt die Lokalisation des Dam1 Komplexes während der Metaphase. Im Gegensatz dazu ist die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex resistent gegenüber der Phosphorylierung durch Ipl1/Aurora B. Biochemische und strukturelle Analysen legen offen, dass Bim1 die Oligomerisierung des Dam1 Komplexes in unvollständige Ringe mit einem einheitlichen Radius auslöst. Zusätzlich rekrutiert Bim1 das Protein Bik1/CLIP-170 zum Dam1 Komplex hinzu und induziert dadurch die Assemblierung vollständiger Ringe sogar in der Abwesenheit von Mikrotubuli. Auf Grundlage dessen ist die Bindung von Bim1 und Bik1/CLIP-170 ein neuartiger Mechanismus, der die Bildung des Dam1c-Rings reguliert. Somit ist Bim1, zusammen mit Phosphorylierung des Dam1 Komplexes durch Cdk1 und Ipl1/Aurora B, einer von nun drei bekannten Mechanismen zur Regulation der Bildung des Dam1c-Rings. In vivo Analysen zeigen, dass das Wachstum von Hefezellen, vor allem bei niedrigen Temperaturen, verlangsamt ist, wenn mehrere dieser regulatorischen Mechanismen gleichzeitig beeinträchtigt sind. Dies deutet darauf hin, dass die Oligomerisierung des Dam1 Komplexes für die Bildung vollständiger Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen entscheidend ist.
Durch Kopplung des Dam1 Komplexes an den Ndc80 Komplex werden letztlich belastbare Kinetochor-Mikrotubulus-Bindungen generiert. Biochemische Rekonstitutionsexperimente zeigen, dass der Dam1 Komplex entweder mit Bim1-Bik1 oder mit dem Ndc80 Komplex interagiert. Diese Beobachtung impliziert, dass der Dam1c-Bim1-Bik1 und Dam1c-Ndc80c Komplex zwei biochemisch unterschiedliche molekulare Varianten des Dam1 Komplexes sind, die möglicherweise zu verschiedenen Zeitpunkten des Aufbaus stabiler Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen existieren.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex ein wichtiger Schritt zur Regulierung des Aufbaus des äußeren Kinetochors ist und dazu dient, die Oligomerisierung und Anreicherung des Komplexes am Kinetochor zu kontrollieren. Mps1-Aktivität am Kinetochor fördert die Interaktion mit Bim1 und gewährleistet eine spezifische Anreicherung des Dam1 Komplexes in der Nähe von Kinetochoren, die keine Mikrotubuli gebunden haben. Dadurch wird gleichzeitig eine Anreicherung des Komplexes an anderen Mikrotubuli, zum Beispiel der Mittelzone der Spindel, verhindert. Zusätzlich fungiert Bim1 möglicherweise als Platzhalter, der anfangs den Dam1 Komplex am Plus-Ende eines Mikrotubulus positioniert und anschließend durch den Ndc80 Komplex ersetzt wird, um korrekt konfigurierte Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen herzustellen. Vorherige Berichte über die physische Interaktion des Ska Komplexes aus Metazoa, des funktionellen Homolog des Dam1 Komplexes, und dem Mikrotubulus Plus-Enden-bindenden Protein EB1 legen die Vermutung nahe, dass die mechanistischen Grundlagen, die in der vorliegenden Dissertation beschrieben werden, unter Eukaryoten weit verbreitet und konserviert sind.
Obwohl zahlreiche Eigenschaften des Dam1 Komplexes in den vergangenen zwei Jahrzehnten mittels genetischer, zellbiologischer, biochemischer, biophysikalischer und strukturbiologischer Ansätze erforscht wurden, ist bis heute wenig darüber bekannt, wie der Komplex selektiv an das Plus-Ende der Kinetochor-Mikrotubuli gelangt. Des Weiteren sind physische Interaktionen des Komplexes mit anderen Proteinen, wie Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs), wenig erforscht.
In der vorliegenden Studie wird die Interaktion des Dam1 Komplexes mit dem autonomen Plus-Ende-bindenden Protein Bim1/EB1 mittels einer Kombination aus genetischen, zellbiologischen und biochemischen Methoden untersucht. Zusätzliche liefern elektronenmikroskopische Daten nach Negativkontrastierung und chemisches Crosslinking Einblicke in die Struktur des Dam1c-Bim1 Komplexes. Bim1 lagert sich in der Nähe der sogenannten Protrusion-Domäne an den Dam1 Komplex an, indem es eine konservierte SxIP-Sequenz im C-Terminus der Untereinheit Duo1 bindet. Die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex wird für eine vollständige Rekrutierung des Komplexes an das Kinetochor während der Metaphase und den korrekten zeitlichen Verlauf der Mitose benötigt. Phosphorylierung durch die konservierte Kinase Mps1 verstärkt die Interaktion zwischen Dam1c und Bim1 und Überexpression von Mps1 beeinträchtigt die Lokalisation des Dam1 Komplexes während der Metaphase. Im Gegensatz dazu ist die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex resistent gegenüber der Phosphorylierung durch Ipl1/Aurora B. Biochemische und strukturelle Analysen legen offen, dass Bim1 die Oligomerisierung des Dam1 Komplexes in unvollständige Ringe mit einem einheitlichen Radius auslöst. Zusätzlich rekrutiert Bim1 das Protein Bik1/CLIP-170 zum Dam1 Komplex hinzu und induziert dadurch die Assemblierung vollständiger Ringe sogar in der Abwesenheit von Mikrotubuli. Auf Grundlage dessen ist die Bindung von Bim1 und Bik1/CLIP-170 ein neuartiger Mechanismus, der die Bildung des Dam1c-Rings reguliert. Somit ist Bim1, zusammen mit Phosphorylierung des Dam1 Komplexes durch Cdk1 und Ipl1/Aurora B, einer von nun drei bekannten Mechanismen zur Regulation der Bildung des Dam1c-Rings. In vivo Analysen zeigen, dass das Wachstum von Hefezellen, vor allem bei niedrigen Temperaturen, verlangsamt ist, wenn mehrere dieser regulatorischen Mechanismen gleichzeitig beeinträchtigt sind. Dies deutet darauf hin, dass die Oligomerisierung des Dam1 Komplexes für die Bildung vollständiger Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen entscheidend ist.
Durch Kopplung des Dam1 Komplexes an den Ndc80 Komplex werden letztlich belastbare Kinetochor-Mikrotubulus-Bindungen generiert. Biochemische Rekonstitutionsexperimente zeigen, dass der Dam1 Komplex entweder mit Bim1-Bik1 oder mit dem Ndc80 Komplex interagiert. Diese Beobachtung impliziert, dass der Dam1c-Bim1-Bik1 und Dam1c-Ndc80c Komplex zwei biochemisch unterschiedliche molekulare Varianten des Dam1 Komplexes sind, die möglicherweise zu verschiedenen Zeitpunkten des Aufbaus stabiler Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen existieren.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Bindung von Bim1 an den Dam1 Komplex ein wichtiger Schritt zur Regulierung des Aufbaus des äußeren Kinetochors ist und dazu dient, die Oligomerisierung und Anreicherung des Komplexes am Kinetochor zu kontrollieren. Mps1-Aktivität am Kinetochor fördert die Interaktion mit Bim1 und gewährleistet eine spezifische Anreicherung des Dam1 Komplexes in der Nähe von Kinetochoren, die keine Mikrotubuli gebunden haben. Dadurch wird gleichzeitig eine Anreicherung des Komplexes an anderen Mikrotubuli, zum Beispiel der Mittelzone der Spindel, verhindert. Zusätzlich fungiert Bim1 möglicherweise als Platzhalter, der anfangs den Dam1 Komplex am Plus-Ende eines Mikrotubulus positioniert und anschließend durch den Ndc80 Komplex ersetzt wird, um korrekt konfigurierte Kinetochor-Mikrotubulus-Verbindungen herzustellen. Vorherige Berichte über die physische Interaktion des Ska Komplexes aus Metazoa, des funktionellen Homolog des Dam1 Komplexes, und dem Mikrotubulus Plus-Enden-bindenden Protein EB1 legen die Vermutung nahe, dass die mechanistischen Grundlagen, die in der vorliegenden Dissertation beschrieben werden, unter Eukaryoten weit verbreitet und konserviert sind.