Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in the world, and non-small cell lung cancers (NSCLC) account for 85% of all lung cancers. Despite recent advances in NSCLC treatment, the 5-year survival rate remains low. Deeper understanding of signaling pathways involved in the hallmarks of lung cancer, such as proliferation, resistance to cell death, immune escape, and metastasis, paved the way towards the development of molecularly targeted therapies. While modern drug therapies of NSCLC aim to target specific oncogenic aberrations or immune escape mechanisms, radiotherapy still is not taking into account the individual tumor biology. In order to identify new targets for “personalized” radiosensitization therapy of NSCLC, our group performed a functional in vitro short hairpin ribonucleic acid (shRNA) screen in NSCLC cells treated with irradiation. Syntaxin 18 (STX18) was one of the candidates emerging from this screen, which was selected for further validation. STX18 is a protein located on the endoplasmic reticulum (ER) membrane and involved in vesicular transport between the Golgi apparatus and ER. The shRNA-mediated suppression of STX18 in human NSCLC cell lines consistently increased apoptosis and reduced clonogenic survival following irradiation. RNA profiling of NSCLC cells with STX18 knockdown identified suppression of genes involved in deoxyribonucleic acid (DNA) replication and repair. Depletion of STX18 associated with decreased phosphorylation of the checkpoint kinase ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) and its downstream target checkpoint kinase 1 (Chk1) in response to irradiation-induced DNA damage. Accordingly, stabilization of the tumor suppressor protein p53 was impaired. This identifies a role for STX18 in the regulation of the DNA damage checkpoint in lung cancer cells. In addition, a suppression of genes involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) and an increase in epithelial markers was observed upon STX18 knockdown, which was confirmed by protein expression studies. This associated with reduced expression and activity of matrix metalloproteinases and impaired capacity to invade, migrate and resist anoikis in vitro. This nominates STX18 as regulator of metastatic processes. To our knowledge, this is the first study identifying STX18 as a modulator of two key mechanisms of clinical failure of radiotherapy in NSCLC, radioresistance and metastatic relapse. Our findings may provide a lead for innovative radiosensitization strategies to improve lung cancer treatment.
Weltweit ist Lungenkrebs die häufigste krebsbedingte Todesursache. Etwa 85% der Lungenkarzinome weisen eine sogenannte nicht-kleinzellige Histologie (NSCLC) auf. Trotz deutlicher Verbesserungen der Diagnose- und Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit NSCLC ist deren 5 Jahres-Überlebensrate weiterhin eine der ungünstigsten aller Krebserkrankungen. Auf dem Boden eines zunehmenden mechanistischen Verständnisses der Biologie verschiedener Unterformen von NSCLC konnten in den vergangenen 15 Jahren Ansatzpunkte für molekular zielgerichtete Behandlungen gefunden und in Pharmakotherapien umgesetzt werden. Diese zielgerichteten Therapien werden, dem Paradigma der „Präzisionsonkologie“ folgend, nur solchen Patienten verabreicht deren NSCLC die entsprechenden prädiktiven Biomarker exprimieren. Im Gegensatz hierzu werden Strahlentherapien sowie zur Radiosensitivierung ergänzte Medikamente, wie Cisplatin, Etoposid oder Vinorelbin, heute weiterhin unselektiv eingesetzt. Es ist jedoch davon auszugehen, dass molekulare Determinanten die individuelle Strahlensensitivität von NSCLC beeinflussen. Um solche Modulatoren der Strahlenantwort von NSCLC zu identifizieren, führte unsere Gruppe ein funktionelles Screening von bestrahlten NSCLC-Zellpopulationen durch, welche eine short hairpin ribonucleic acid (shRNA)- Bibliothek exprimierten. Dabei wurde das Gen STX18 als möglicher Modulator der Strahlenantwort von NSCLC identifiziert. STX18 kodiert das Protein Syntaxin 18, welches im Transport von Vesikeln zwischen dem Endoplasmatischem Retikulum und dem Golgi-Apparat involviert ist. Die shRNA-vermittelte Depletion von Syntaxin 18 sensitivierte humanen Lungenkrebszelllinien konsistent gegenüber strahleninduzierter Apoptose und Reduktion des klonogenen Überlebens. Genexpressionsanalysen dieser Zellen wiesen eine signifikante Herunterregulierung von DNA-Replikations- und Reparaturfaktoren nach Strahlentherapie nach. Funktionell zeigte sich eine reduzierte Phosphorylierung der Kinasen ATR und Chk1 mit konsekutiver Reduktion des Tumorsuppressors p53. Diese Ergebnisse etablieren eine Rolle von Syntaxin 18 in der Regulation der Reparatur und des Zellzyklus-Checkpoints nach strahleninduzierten DNA-Schäden. Die Suppression von STX18 interferiert mit diesen essentiellen Mechanismen und sensitiviert dadurch Lungenkarzinomzellen gegenüber einer Strahlentherapie. Interessanterweise wiesen NSCLC-Zellen mit Suppression von Syntaxin 18 eine zusätzliche Reduktion der Genexpression von Regulatoren der epithelialmesenchymalen Transition (EMT), einem für die Metastasierung bedeutsamen phänotypischen Prozess, auf. Dies korrelierte mit einer verstärkten Gen- und Proteinexpression epithelialer Marker entsprechend einer Arretierung Syntaxin 18- depletierter Zellen in einem epithelialen Phänotyp. Ebenso zeigte sich eine reduzierte Expression und Funktion von Matrixmetalloproteinase und verminderte Invasions- und Migrationskapazität. Nach unserem Kenntnisstand konnten diese Untersuchungen erstmalig Syntaxin 18 als relevanten Faktor in der Resistenz gegenüber Strahlentherapie sowie als Modulator der Metastasierung identifizieren. Diese Erkenntnisse können einen Ansatzpunkt für biologisch rationale Strategien zur Vermeidung von Resistenz und Rückfällen nach Strahlentherapie von Patienten mit Lungenkarzinomen darstellen.
