Mechanistic insights into the mitotic checkpoint through biochemical characterisation and in vivo method development
During mitosis, the accurate segregation of chromosomes to daughter cells is ensured by the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Incorrect attachments of spindle microtubules with kinetochores triggers the SAC signaling and results in the assembly of an effector complex called Mitotic Checkpoint Complex (MCC). Recent studies have identified that the SAC signaling kinetochores provide a catalytic platform for the MCC assembly. To ensure the timely activation and inactivation of SAC signaling, MCC disassembly occurs in parallel with its assembly. TRIP13, a AAA+ ATPase along with its cofactor p31COMET catalyzes the MCC disassembly mainly in cells. My PhD work aim to provide some mechanistic insights into the regulation of both MCC assembly and disassembly processes.
During this work, I established electroporation (EP) as a method to deliver recombinant proteins into mammalian cells for the purpose of functional studies using kinetochore and SAC proteins. Our data provides a better comprehension of the spatial distribution of MCC in SAC signaling cells. MCC disassembly was characterized in vitro using biochemical assays. I demonstrated that CDK1 phosphorylation of p31COMET impaired its interaction with TRIP13. Additionally, this study showed for the first time that MAD1:C-MAD2 complex is a TRIP13 pseudo-substrate and the interaction between this substrate-enzyme pair is negatively regulated by the CDK1 phosphorylation of p31COMET . In vitro experiments showed that the previously identified MCC assembly catalysts displace p31COMET from MAD1:C-MAD2 complex in order to favor O-MAD2 dimerization. In a cellular context, this would help to increase the p31COMET accumulation in cytosol for MCC disassembly during checkpoint. Collectively, my PhD work demonstrates that MCC disassembly is regulated in unison with the number of SAC signaling kinetochores. This proposed mechanism of regulation would ensure that SAC signaling is both adaptive and robust.
Tochterzellen durch den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) sichergestellt. Falsche
Bindungen der Spindel-Mikrotubuli an Kinetochore lösen die SAC-Signalisierung aus
und führen zur Bildung eines Effektor-Komplexes, der Mitotic Checkpoint Complex
(MCC) genannt wird. Neue Studien haben gezeigt, dass Kinetochore, die den SAC
signalisieren, eine katalytische Plattform für die MCC-Assemblierung darstellen. Um
die rechtzeitige Aktivierung und Inaktivierung der SAC-Signalisierung zu
gewährleisten, erfolgt der Abbau des MCC parallel zu seinem Aufbau. TRIP13, eine
AAA+ ATPase katalysiert zusammen mit seinem Kofaktor p31COMET hauptsächlich den MCC-Abbau in Zellen. Das Ziel dieser Arbeit ist es einige mechanistische Einblicke in die Regulation des MCC-Aufbaus als auch des MCC-Abbaus zu gewinnen.
Während dieser Arbeit etablierte ich die Elektroporation (EP) als Methode um
rekombinante Proteine in Säugetierzellen einzubringen. Dies ermöglichte die
Durchführung funktioneller Studien mit Kinetochore und SAC-Proteinen in vivo.
Unsere Daten liefern ein besseres Verständnis für die räumliche Verteilung des MCC
in SAC-signalisierenden Zellen. Der Abbau des MCC wurde in vitro mit biochemischen
Assays charakterisiert. Ich konnte zeigen, dass die CDK1-Phosphorylierung von
p31COMET die Interaktion mit TRIP13 beeinträchtigt. Außerdem erwies diese Studie
zum ersten Mal, dass der MAD1:C-MAD2-Komplex ein TRIP13-Pseudosubstrat ist
und die Interaktion zwischen diesem Substrat-Enzym-Paar durch die CDK1-
Phosphorylierung von p31COMET negativ reguliert wird. In vitro-Experimente zeigten,
dass p31COMET durch die zuvor identifizierten MCC-Assembly-Katalysatoren aus dem MAD1:C-MAD2-Komplex verdrängt wird. Dies wiederum begünstigt die O-MAD2-
Dimerisierung. In einem zellulären Kontext würde dies dazu beitragen, die p31COMETAkkumulation im Zytosol für den MCC-Abbau während des Checkpoints zu steigern. Insgesamt zeigt meine Doktorarbeit, dass der MCC-Abbau im Einklang mit der Anzahl der SAC-signalisierenden Kinetochore reguliert wird. Dieser Mechanismus der Regulierung würde sicherstellen, dass die SAC-Signalisierung sowohl adaptiv als auch robust ist.