Molecular function of SEP domain adapters in VCP/p97 mediated protein unfolding
The ATPase p97 (also known as VCP) is a member of family of AAA+ ATPases, a group of enzymes that form hexameric rings and unfold substrate proteins by ATP powered translocation through the central channel. The protein is highly conserved in metazoans, with homologues found in yeast (Cdc48) and flies (Ter94) and represents up to 1% of the total protein mass in the cell. Its main function is the extraction and subsequent unfolding of mostly ubiquitinated substrate proteins from membranes and protein complexes. In this capacity, p97 is an important factor in many cellular processes, including proteasomal degradation of misfolded proteins, clearance of cellular organelles via autophagy, cell cycle regulation and DNA repair. Substrate specificity is controlled by adapter proteins and cofactors that control substrate recruitment and p97 activity. Although up to 30 different proteins that interact with p97 in this manner have been identified, the exact mechanism by which these adapters facilitate substrate processing by p97 is only sufficiently understood for the Ufd1-Npl4 pair, which is the major adapter for polyubiquitinated substrates. Recent discoveries had identified the SDS22-PP1-I3 (SPI) complex, which forms during biogenesis of the phosphatase PP1, as a new substrate, whose disassembly by p97 together with the adapter p37 was not dependent on ubiquitination.
This thesis focused on the elucidation of the mechanism by which adapter proteins from the family of SEP domain containing proteins (p37, p47, UBXN2A, UBXN11) facilitate this process. We established a new in vitro fluorescence-unfolding assay that allowed us to determine that I3 is being unfolded by p97 during SPI complex disassembly. Further investigation on the function of p37 and the differences with the other three SEP domain proteins revealed that only UBXN2A was equally capable to support the unfolding reaction, while p97 remained inactive in the presence of p47 or UBXN11. Systematic exchange of protein domains between p37 and p47 showed that the inability of p47 to support unfolding was caused by a divergence in the sequence of a C-terminal linker region, which was found to be critical for binding of the SPI complex by p37. Furthermore, p47 impeded unfolding through inhibition of the ATPase activity of p97 by a “brake” motif in its N-terminal region.
Additional investigations into the N-terminal structure of p37 led to the identification of an amphipathic helix that was important for efficient unfolding. Using genetically encoded crosslinkers and mass spectrometry we could show that p37 recruits the SPI complex through a multivalent interface, which includes the N-terminal helix, the SEP domain and the C-terminal linker. This interaction involves binding of I3 by the N-terminus and the SEP domain of p37 close to the pore of p97, while the C-terminal linker of p37 binds to PP1 and positions at a distance from the pore. This primes I3 as the unfolding substrate of p97 and prevents unfolding of PP1. These results demonstrate the mechanism by which the SEP domain adapters direct unfolding of a non-ubiquitinated substrate of p97.
Die ATPase p97 (auch als VCP bekannt) ist ein Mitglied der Familie der AAA+ ATPasen, einer Gruppe von Enzymen welche ringförmige Hexamere bilden und Substratproteine durch von ATP Hydrolyse getriebene Translokation durch die zentrale Pore entfalten. Das Protein ist in Metazoen hochkonserviert, mit Homologen welche in Hefen (Cdc48) und Fliegen (Ter94) vorkommen und macht bis zu 1% der gesamten Proteinmasse in einer Zelle aus. Seine Hauptfunktion ist die Extraktion und darauffolgende Entfaltung von meistens ubiquitinierten Substratproteinen aus Membranen und Proteinkomplexen. In dieser Funktion spielt p97 eine bedeutende Rolle für viele Zelluläre Prozesse, darunter der Abbau von fehlgefalteten Proteinen durch das Proteasom, der Abbau von Zellorganellen durch Autophagie, die Regulation des Zellzyklus und die DNA-Reparatur. Substrate Spezifität wird durch Adapter Proteine und Kofaktoren vermittelt, welche die Substrate Rekrutierung und die Aktivität von p97 kontrollieren. Obwohl bis zu 30 verschiedene Proteine, die mit p97 auf diese Weise interagieren, identifiziert worden sind, ist der genaue Mechanismus, durch den diese Adapter zur Prozessierung der Substrate durch p97 beitragen nur für das Adapterpaar Ufd1-Npl4 ausreichend verstanden. Ufd1-Npl4 ist der hauptsächliche Adapter für die polyubiquitinierte Substrate. Neueste Entdeckungen haben den SDS22-PP1-I3 (SPI) Komplex, welcher sich während der Biogenese von PP1 formt, als ein Substrat identifiziert, das von p97 zusammen mit dem Adapter p37 auseinandergenommen wird. Dieser Vorgang ist unabhängig von Ubiquitinierung.
Diese Arbeit behandelt die Aufklärung des Mechanismus durch den Adapterproteine aus der Familie der SEP-Domänen Adapter (p37, p47, UBXN2A, UBXN11) diesen Vorgang ermöglichen. Wir entwickelten einen neuen in vitro Fluoreszenz-Entfaltungsassay, durch den wir bestimmen konnten, dass I3 während des Auseinandernehmens des SPI-Komplexes durch p97 entfaltet wird. Weitere Untersuchungen der Funktion von p37 and der Unterschiede zu den anderen drei SEP-Domänen Adaptern zeigten, dass nur UBXN2A ebenfalls in der Lage ist die Entfaltung zu ermöglichen, während p97 in Gegenwart von p47 oder UBXN11 inaktiv bleibt. Durch systematischen Austausch von Proteindomänen zwischen p37 und p47 konnten wir das Unvermögen von p47 die Entfaltung zu unterstützen auf den Unterschied in der Sequenz eines Linkers in der C-terminalen Region der Adapter zurückführen. Es zeigte sich, dass dieser Linker von entscheidender Bedeutung für die Bindung des SPI-Komplexes durch p37 ist. Weiterhin erschwert p47 die Entfaltung durch Inhibition der ATPase Aktivität von p97 mittels eines „Brems“ Motivs in der N-terminalen Region.
Zusätzliche Untersuchungen der Struktur der N-terminalen Region von p37 führten zur Identifikation einer amphipathischen Helix, welche für die effiziente Entfaltung wichtig ist. Durch den Einsatz von genetisch kodierten Crosslinkern und Massenspektrometrie konnten wir zeigen, dass p37 den SPI-Komplex mittels einer multivalenten Oberfläche bindet, die aus der N-terminalen Helix, der SEP-Domäne und dem C-terminalen Linker besteht. Diese Interaktion involviert die Bindung von I3 durch den N-terminus und die SEP-Domäne von p37 in geringem Abstand zur zentralen Pore von p97, während der C-terminale Linker PP1 bindet und auf Distanz zur Pore positioniert. Dies fördert die Entfaltung von I3 als dem Substrat von p97 und verhindert ungewolltes Entfalten von PP1. Diese Ergebnisse geben Aufschluss über den Mechanismus durch den die SEP-Domänen Adapter die zur Entfaltung von nicht-ubiquitinierten Substraten von p97 beitragen.