Elektrophoretische und chromatographische Trennverfahren gekoppelt mit Driftzeit Ionenmobilitätsspektrometrie – leistungsstarke Analysenplattformen für komplexe Proben
In dieser Arbeit wurde:
1. dieCollision Cross Sections (CCS) einesseit wenigen Jahren kommerziell verfügbarenDriftzeit IM-QTOF-MS Systems hinsichtlich der Vergleichbarkeit mit einem Traveling wave IMS-System untersucht und mögliche Einflussfaktoren auf die CCS-Bestimmung ermittelt,
2. derEinfluss der Ionensammelzeit auf die Detektorsättigung, die Nachweisgrenze, den linearen Bereichund die Massengenauigkeit in Abhängigkeit von der Molekülgrößeim Standard IM-und Multiplexed-Modusuntersucht
3. die erstmalige Kopplung der Kapillarzonenelektrophorese (CZE) mit einem DTIM-MSfür die Analyse verschiedener N-Glykanerealisiert,
4. die Leistungsfähigkeit verschiedener ein-und zweidimensionaler LC-Methoden mit DTIM-MS anhand von Pflanzenextrakt-, Abwasser-und Biokohle-Proben evaluiert und5.schließlich eine LC+LC-Methode optimiert und komplexe Kräuterlikörproben mittels Kapillar-LC+LC-DTIM-MS analysiert.
Zur Überprüfung der Möglichkeit von universellen CCS-Datenbanken wurde die Vergleichbarkeit von CCS-Werten, bestimmt mit einem Driftzeit IM-QTOF-MS System und einem Traveling wave IM-QTOF-MS, untersucht. Dabei zeigte sich eine gute Korrelation beider Gerätetypen mit einer Abweichung <1% für die meisten untersuchten Komponenten. Allerdings weisen Abweichungen von bis zu 6,2% darauf hin, dassCCS-Datenbanken nicht ohne Weiteres wechselseitig genutzt werden können. Die mit TWIM-MS ermittelten CCS-Wertestimmten nicht mit ausreichender Sicherheit überein, wenn CCS-Toleranzen von unter 1% für eine Datenbanksuche gewählt wurden. Mit höheren CCS-Toleranzen würden jedoch die falsch-positiven Zuordnungen zunehmen und zu einer abnehmenden Wahrscheinlichkeit einer sicheren Identifizierung führen. Andererseits, auch wenn die Vergleichbarkeit zwischen beiden Instrumententypen nicht vollständig gegeben war, können die CCS-Werte reziprok verwendet werden, um eindeutig falsche Zuordnungen bei der Identifizierung von unbekannten Substanzen auszuschließen. Beim Aufbau einer CCS-Datenbank sowie bei deren Nutzung sollte somit immer auch der Instrumententyp und die CCS-Methode berücksichtigt werden.Zur erweiterten Beurteilung der Vergleichbarkeit verschiedener IMS-Systeme sollten weitere Substanzen aus unterschiedlichen Klassen untersucht und auch mit dem kürzlich kommerzialisierten TIMS-Gerät analysiert und verglichen werden.Es wurde außerdem der Einfluss unterschiedlicher Ionisationsbedingungen auf die Reproduzierbarkeit der CCS-Werte untersucht. Hierfür wurden verschiedene LC-und Ionisations-Parameter (Zusammensetzung und Flussrate des LC-Eluenten, Dry Gas Temperatur und Flussrate) variiert, um festzustellen, ob Änderungen in den Driftspektren auftreten unddiese einen Einfluss auf die resultierenden CCS-Werte haben.Hierbei zeigte sich für die untersuchten Standards kein signifikanter Einfluss der verschiedenen Ionisationsbedingungen auf den CCS-Wert. Die Abweichung der durchschnittlich ermittelten CCS-Wertevom Datenbankwert betrug maximal 0,4% und lagsomit im Bereich der Messunsicherheit des Geräts. Änderungen im Driftspektrum konnten nur für Karbutilat unter extremen Bedingungen beobachtet werden und könnten darauf zurückzuführen sein, dass unterschiedliche LC-Bedingungen (Lösemitteltyp und -menge) unterschiedliche Protonierungsstellen im Molekül präferieren. Aus diesem Grund sollten beim Aufbau einer CCS-Datenbank neben der IMS-Technik auch die experimentellen Einstellungen spezifiziert werden.Weiterhin wurden verschiedene IM-Modi (Standardund Muliplexed IM-Modus) verglichen, um den Einfluss verschiedener Ionensammelzeiten auf die Signalintensität, die Empfindlichkeit und die Massengenauigkeit zu untersuchen.Hierbei wurden für alle drei eingesetztenStandards im Multiplexed IM-Modus deutlich größere Peakhöhen für die gleichen Konzentrationen erreicht als im Standard IM-Modus. Die Verwendung des Multiplexed IM-Modus führte bei allen drei untersuchten Standards zu einer höheren Signalintensität, eine gesteigerte Empfindlichkeit sowie zu einer besseren Massengenauigkeit, bedingt durch die geringeren Sammelzeiten in der Ionenfalle und den dadurch verringerten Raumladungs-und Detektorsättigungseffekten. Die größten Auswirkungen der Multiplexing Technik konnten für das kleinste der untersuchten Moleküle beobachtet werden. Die optimale Sammelzeit und der davon abhängige IM-Modus (Standard oder Multiplexed) ist insgesamt abhängig von Menge und dem m/zder zu analysierenden Komponenten.Die Kopplung der CZE mit DTIM-MS konnte erfolgreich für die Trennung und Charakterisierung von nativen und APTS-markierten N-Glykanen, freigesetzt aus verschiedenen Proteinquellen, umgesetzt werden. Dabei zeigten die einzelnen, mittels CZE getrennten Glykansignale grundsätzlich mehrere Driftpeaks. Ohne eine vorangehende Trennung in der CZE-Dimension könnte jedoch die Komplexität mancher N-Glykane nicht mit DTIM-MS allein aufgelöst werden und würde zu einer Überlagerung der Driftspektren führen. Dies verdeutlicht die Vorteile, die mit der Kombination beider leistungsstarken Analysetechniken erreicht werden konnten.Außerdem wurde gezeigt, dass Art und Zusammensetzung des sheath liquids keinen erwähnenswertenEffekt auf die Driftspektren haben, so dass die Zusammensetzung z.B. hinsichtlich der Ionisationseffizienz unabhängig vom DTIM-MS System optimiert werden kann. Darüber hinaus wurde die Leistungsfähigkeit verschiedener ein-und zweidimensionaler LC-Methoden mit anschließender IM-QTOF-MS Detektion evaluiert. Hierfür wurden für eine LC-Methode mit 250mmbzw. 1000mm (4x250mm seriell gekoppelt) langeSäulen sowie für eine LC+LC-und LCxLC-Methode diechromatographische Auflösungausgewählter Standardsubstanzen, dieMatrixeffekte und diePeakkapazität bestimmt. Die beste Auflösung und die größte Peakkapazität wurden dabei mit der 1D-LC mit 1000mmSäule erzielt. Eswurde außerdem anhand einiger Beispiele untersucht, inwieweit isobare, strukturähnliche Substanzen mittels IM-QTOF-MS getrennt werdenkönnen. Dabei zeigte sich, dass sich manche Konstitutionsisomere ausreichend in ihren Stoßquerschnitten unterscheiden, während bei anderen Analyten die Strukturunterschiede nicht groß genug für eine Auftrennung in der Driftröhrewaren.Weiterhin wurde beobachtet, dass sich abhängig von der Adduktion eines Protons bzw. eines Natriumions, die CCS-Werte mehr oder weniger unterscheiden.Abschließend wurdeeine LC+LC-Methode durch Miniaturisierung in der ersten Dimension und durch Wahl einergeeigneten Kombination aus stationären und mobilen Phasenerfolgreich weiterentwickelt, um das Peaktailing in der ersten Dimension deutlich zu reduzieren. Im Anschluss wurde die cLC+LC-Methode für die Anwendung auf komplexe Proben weiter optimiert. Anhandder Analyse verschiedener Kräuterlikörproben konnte die Wiederholpräzision der optimierten cLC+LC-Methode sowie das reduzierte Tailing in dererstenDimension in Realmatrix veranschaulicht werden. Es konnten außerdem einige phenolische Probenbestandteile unter Verwendung von Standards identifiziert werden. Für eine umfangreiche Charakterisierung und Identifizierung der Probenkomponenten sollte eine Featureanalyse und ein anschließender CCS-Datenbankabgleich durchgeführt werden. Die Arbeit zeigt, dass die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie erst in Verbindung mit weiteren Trennsystemen das volle Potential für Non-target-Analysen ausschöpft, tiefeEinblicke in die Komplexität verschiedener Proben liefert und auch die Identifizierung von Substanzen über deren CCS-Werte erleichtert
Drift tube ion mobility spectrometry (IMS) provides great separation power in combination with liquid chromatography (LC) and high resolution mass spectrometry (HRMS). Besides, it allows the determination of collision cross sections (CCS) as an intrinsic molecular descriptor and additional parameter to identify compounds in complex mixtures.
A drift tube ion mobility quadrupole time-of-flight mass spectrometry (DTIM-QTOF-MS) system, which has been commercially available since 2014, was investigated with respect to its CCS determination properties and coupled to different analytical separation methods in liquid phase for the analysis of different complex samples.
For this purpose, a comparison of CCS values of small molecules determined by drift tube ion mobility mass spectrometry (DTIM-MS) and traveling wave ion mobility mass spectrometry (TWIM-MS) was carried out to check the possibility of a common database. A good correlation of both devices were observed with a deviation < 1 % for most of the investigated components. However, deviations of up to 6.2 % indicate that CCS databases cannot be used mutually. Even if the comparability between the two types of instruments was not fully ensured, the CCS values can be used reciprocally to exclude clearly incorrect allocations when identifying unknown substances. In conclusion, instrument type and CCS method should always be taken into account when setting up a CCS database and using it. Also, the influence of different ionization conditions on the reproducibility of CCS values was investigated. Therefore, different LC and ionization source parameters (composition and flow rate of the LC eluent, dry gas temperature and flow rate) were varied to determine whether changes in the drift spectra occur and whether these have an influence on the resulting CCS values. For the standards investigated, no significant influence of the different ionization conditions on CCS values was found. The maximum deviation of the average experimental CCS values from the database values was 0.4 %, which is within the range of uncertainty for this instrument. In addition, different IM modes (standard and multiplexed IM mode) were compared to evaluate the influence of different ion trap times on signal intensity and mass accuracy. For all three investigated standards, significantly larger peak heights were achieved in the multiplexed IM mode for the same concentrations than in the standard IM mode. The use of the multiplexed IM mode resulted in shorter trapping times in the trapping funnel, causing reduced space charge and detector saturation effects. This increases the signal intensity and the sensitivity and improves the mass accuracy for the investigated standards. Besides, the limit of detection could be reduced for the smallest of the investigated molecules by using the multiplexed IM mode.
Furthermore, the first coupling of a capillary zone electrophoresis (CZE) to a DTIM-MS instrument was realized and applied for separation and characterization of native and APTS labelled N-glycans showing the advantages of combining two powerful analytical techniques.
The separation power of different one- and two-dimensional LC-techniques with subsequent IM-QTOF-MS detection was evaluated. A standard LC method with a 250 mm and a 1000 mm column (coupling of four 250 mm columns in series), respectively, were compared to a LC+LC and LCxLC method in terms of chromatographic resolution, ion suppression and peak capacity.
Finally, an existing LC+LC method was successfully further developed by miniaturization in the first dimension and by selecting a suitable combination of stationary and mobile phases in order to significantly reduce peak tailing in the first dimension. Subsequently, the cLC+LC method was further optimized for the analysis of complex samples. The analysis of various herbal liqueur samples was used to illustrate the repeatability of the optimized cLC+LC method and the reduced tailing in the first dimension in real matrices. In addition, some phenolic sample components could be identified using reference standards.
Drift tube ion mobility spectrometry (IMS) provides great separation power in combination with liquid chromatography (LC) and high resolution mass spectrometry (HRMS). Besides, it allows the determination of collision cross sections (CCS) as an intrinsic molecular descriptor and additional parameter to identify compounds in complex mixtures.
A drift tube ion mobility quadrupole time-of-flight mass spectrometry (DTIM-QTOF-MS) system, which has been commercially available since 2014, was investigated with respect to its CCS determination properties and coupled to different analytical separation methods in liquid phase for the analysis of different complex samples.
For this purpose, a comparison of CCS values of small molecules determined by drift tube ion mobility mass spectrometry (DTIM-MS) and traveling wave ion mobility mass spectrometry (TWIM-MS) was carried out to check the possibility of a common database. A good correlation of both devices were observed with a deviation < 1 % for most of the investigated components. However, deviations of up to 6.2 % indicate that CCS databases cannot be used mutually. Even if the comparability between the two types of instruments was not fully ensured, the CCS values can be used reciprocally to exclude clearly incorrect allocations when identifying unknown substances. In conclusion, instrument type and CCS method should always be taken into account when setting up a CCS database and using it. Also, the influence of different ionization conditions on the reproducibility of CCS values was investigated. Therefore, different LC and ionization source parameters (composition and flow rate of the LC eluent, dry gas temperature and flow rate) were varied to determine whether changes in the drift spectra occur and whether these have an influence on the resulting CCS values. For the standards investigated, no significant influence of the different ionization conditions on CCS values was found. The maximum deviation of the average experimental CCS values from the database values was 0.4 %, which is within the range of uncertainty for this instrument. In addition, different IM modes (standard and multiplexed IM mode) were compared to evaluate the influence of different ion trap times on signal intensity and mass accuracy. For all three investigated standards, significantly larger peak heights were achieved in the multiplexed IM mode for the same concentrations than in the standard IM mode. The use of the multiplexed IM mode resulted in shorter trapping times in the trapping funnel, causing reduced space charge and detector saturation effects. This increases the signal intensity and the sensitivity and improves the mass accuracy for the investigated standards. Besides, the limit of detection could be reduced for the smallest of the investigated molecules by using the multiplexed IM mode.
Furthermore, the first coupling of a capillary zone electrophoresis (CZE) to a DTIM-MS instrument was realized and applied for separation and characterization of native and APTS labelled N-glycans showing the advantages of combining two powerful analytical techniques.
The separation power of different one- and two-dimensional LC-techniques with subsequent IM-QTOF-MS detection was evaluated. A standard LC method with a 250 mm and a 1000 mm column (coupling of four 250 mm columns in series), respectively, were compared to a LC+LC and LCxLC method in terms of chromatographic resolution, ion suppression and peak capacity.
Finally, an existing LC+LC method was successfully further developed by miniaturization in the first dimension and by selecting a suitable combination of stationary and mobile phases in order to significantly reduce peak tailing in the first dimension. Subsequently, the cLC+LC method was further optimized for the analysis of complex samples. The analysis of various herbal liqueur samples was used to illustrate the repeatability of the optimized cLC+LC method and the reduced tailing in the first dimension in real matrices. In addition, some phenolic sample components could be identified using reference standards.