Development and application of quantitative proteomics method for S-nitrosylation analysis

Reversible post-translationale Cystein-Modifikationen stellen wichtige Faktoren für Zellsignalisierung und Redox-Homöostase dar. Unter anderem fungiert die S-Nitrosylierung als Redox-Switch in zahlreichen (patho-)physiologischen Vorgängen. Die Erforschung dieser Modifikation auf proteomweiter Ebene sowie im nativen zellulären Kontext bleibt eine Herausforderung, da effiziente Analysemethoden fehlen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neuartige chemo-proteomische Strategie für die quantitative Analyse von reversibel modifizierten Cysteinen entwickelt, die sich bioorthogonal spaltbare Verbindungsmoleküle sowie eine Austauschtechnik zunutze macht (Cys-BOOST). Der direkte Vergleich von Cys-BOOST mit iodoTMT zur Analyse der Cysteinenaus HeLa Zellextrakten zeigte dreifach erhöhte Sensitivität, erheblich höhere Spezifizität und technische Reproduzierbarkeit von Cys-BOOST. Unter Einsatz von Cys-BOOST zur Analyse von S-Nitrosylierungen in mit S-Nitrosoglutathion behandelten sowie unbehandelten HeLa-Zellextrakten konnte eine Vielzahl von S-nitrosylierten Proteinen (3,632) sowie einmaligenS-Nitrosylierungsstellen (8,304) identifiziert werden. Gestützt auf quantitative Daten wurden S-Nitrosylierungsmotive von S-Nitrosylierungsstellen mit unterschiedlicher Reaktivität auf S-Nitrosoglutathion abgeleitet.Diese Motive beweisen die Relevanz von lokaler Hydrophobizität und Säure-Basen-Katalyse für S-Nitrosylierung auf proteomweiter Ebene und beleuchten die herausragende Selektivität von S-NitrosylierungenaufZielproteinen. Die in vitroAnalyse von S-Nitrosylierungen in SH-SY5Y Neuroblastom-Zellen brachte 2,158 spezifische S-Nitrosylierungsstellen auf 1,443 Proteinen im Grundzustand zum Vorschein,sowie signifikant veränderte S-Nitrosylierungsgrade in Proteinen der Neuro(axono)genese, glutamatergischenSynapsentransmission, Cadherin-Bindung, des NADH-Metabolismus und der Proteinfaltung, Translation und DNA-Replikation, als Reaktion auf frühen nitrosativen Stress. Insgesamt etablieren diese Ergebnisse Cys-BOOST als effiziente Methode zur proteomweiten quantitativen Analyse von S-Nitrosylierungen und weisen darauf hin, dass S-Nitrosylierung zur globalen Reaktion der Proteinfunktion ebenso beiträgt wie Phosphorylierung und Ubiquitinierung.

Cite

Citation style:
Ruzanna, M., 2021. Development and application of quantitative proteomics method for S-nitrosylation analysis. https://doi.org/10.17185/duepublico/74156
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved

Export