Deciphering the genetic diversity of pediatric AML using Next Generation Sequencing tools

Pediatric acute myeloid leukemia (AML) is characterized by various genetic changes that can be used for classification in addition to morphological and immunophenotypic criteria. To determine the genetic signature of this disease might help to improve clone- specific therapies and to reduce the toxicity caused by therapy. In order to analyze the genetic profile even of leukemic stem cells, which are described to be the origin of the disease, analysis at the individual cell level in particular can provide more accurate information about clonal evolution in pediatric AML. In this thesis, different NGS tools have been established that enabled detailed and in-depth genetic analysis of pediatric AML subpopulations on both bulk and single cell level. Linking the presence of combinations of specific genetic aberrations with the clinical data of the AML patients has revealed the existence of subgroups of children and adolescents with devastatingly poor outcome that urgently need novel therapies. We used NGS technologies for reliable genetic analysis of single LSC-enriched blasts from pediatric AML patients with known NPM1 mutation and/or FLT3 ITD. Two NGS techniques, targeted amplicon-based sequencing (TS) and whole exome sequencing (WES) was applied to bone marrow bulk cells from pediatric AML patients at diagnosis. In parallel, single AML cells were sorted from a LSC-enriched compartment and DNA was extracted, whole genome-amplified (WGA) and subsequently subjected to whole exome sequencing (WES). We showed that the quality of the amplification achieved with a commercially available WGA kit was sufficient to generate evaluable sequence data and that coverage statistics were comparable between single cell and bulk WES data. Direct comparison between the different NGS methods also revealed that the initial screening of the bulk DNA by WES with read counts between 50–72× failed to detect rare AML subclones. Additionally, we applied targeted NGS for 54 genes associated with myeloid malignancies, which are marker predicting a poor outcome in a contemporary pediatric AML cohort. Two of these genes further analyzed in this thesis were FLT3 and WT1. By using qPCR, we identified another co-occuring prognostic indicator in a subgroup of patients with material for retrospective analysis available, namely NUP98-NSD1 fusions. We could show that co-occurrence of any combination of WT1 mutation, FLT3 ITD and NUP98-NSD1 fusion is a predictor of dismal response for pediatric AML.

Die pädiatrische akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene Erkrankung, bei der neben der morphologischen und immunphänotypischen Charakterisierung vor allem genetische Veränderungen eine große Rolle spielen. Dabei kann die genaue Kenntnis der genetischen Signatur leukämischer Blasten und Stammzellen (LSC) genutzt werden, um die klonale Struktur der Erkrankung zu untersuchen. Die Kenntnis dieser Signatur könnte zu einer Verbesserung klonspezifischer Therapien und nachfolgend zu einer Verringerung der durch die Therapie verursachten Toxizität führen. Dabei kann insbesondere die Analyse auf Einzelzellebene weiterführende Informationen liefern. In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Next Generation Sequencing (NGS) Verfahren etabliert. Diese ermöglichen eine detaillierte genetische Analyse der pädiatrischen AML, auch auf Einzelzellebene. Durch Korrelation spezifischer genetischer Aberrationen mit den klinischen Daten konnten wir bei den pädiatrischen AML-Patienten Subgruppen identifizieren, die ein schlechteres Überleben im Vergleich zur gesamten Gruppe zeigen. Wir konnten zeigen, dass Patienten, bei denen eine Kombination aus zwei von drei Faktoren (WT1 Mutation, FLT3 ITD und NUP98-NSD1 Fusion) vorliegt, eine signifikant schlechtere Prognose haben. Für diese Risikogruppen ist die Verfügbarkeit von neuen Therapien dringend notwendig. Wir wendeten außerdem NGS-Technologien für die genetische Analyse einzelner LSC-angereicherter Blasten von pädiatrischen AML-Patienten mit bekannter NPM1 Mutation und/oder FLT3 ITD an. Für die Sequenzanalyse der DNA der leukämischen Blasten wurde Knochenmark von pädiatrischen AML Patienten mittels genspezifischer amplikonbasierter Sequenzierung (TS) sowie Exomsequenzierung (WES) untersucht. Parallel wurde DNA einzelner Zellen mit stammzellnahem Immunphänotyp extrahiert, das Genom amplifiziert (WGA) und anschließend mittels vollständiger Exomsequenzierung (WES) analysiert. Wir konnten zeigen, dass die Qualität der Genomamplifikation aus Einzelzellen für die Generierung von auswertbaren NGS Daten geeignet war. Die statistische Auswertung der Sequenzdaten zeigte außerdem eine gute Vergleichbarkeit zwischen den Einzelzell- und den aus den aus dem nicht angereicherten Knochenmark generierten Daten. Der direkte Vergleich der verschiedenen NGS-Methoden ergab, dass die mit WES erreichte Lesetiefen zwischen 50-72X nicht zur Identifizierung von seltenen AML-Subklonen ausreichend sind.


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