DSB clusters impair the efficiency of both homologous recombination and c-NHEJ and initiate Rad52 dependent error prone processing

Chaudhary, Shipra GND

The results presented in this thesis reveal that with increasing DSB clustering and thus with increasing complexity of the DSB, there is increased engagement of DNA end processing pathways utilizing CtIP. However, as of yet uncharacterized CtIP-independent DSB processing pathways may also engage. DSB clustering and thus increased complexity of DSBs causes a larger dependence on “error-prone” DSB processing pathways such as alt-EJ and SSA. In this setting, it seems that the resection independent c-NHEJ and the resection dependent and error- free HRR play a less significant role in the repair of more complex DSB clusters. Increased involvement of HRR in the repair of complex DSBs induced after exposure to high LET IR has been suggested in the literature but has not been confirmed in biological systems in which defined forms of complex DSBs have been generated; as it was carried out here. One apparent discrepancy with this framework of thinking is that since HRR is an error free repair pathway, its increased utilization would contradict the greater incidence of chromosomal aberrations forming after exposure to high LET IR. It is therefore possible that although HRR engages, it cannot complete processing and thus other resection mediated error prone pathways take over causing the translocation observed. The biological system that has been used in this thesis is a unique tool that allows us to introduce clean DSBs and clusters of DSBs in a controlled manner. The plethora of clones that are available with these integrations give us a diverse range of DSB complexity ranging from simple DSBs to DSB pairs and even DSB quadruplets in CHO wild type, and in mutants of DNA-PKcs, Ku80 and XRCC3. These clones allow the investigation as to which repair pathways engage as the complexity of the DSB increases, and how this causes the increased occurrence of chromosomal translocations. Key findings of these experiments are summarized below: Inhibition of Parp1 dependent alt-EJ results in the expected decrease in the formation of translocations, with the decrease being more significant in clones with DSB clusters. This expected decrease is not observed in DNA-PKcs clones harboring incompatible DSB ends and instead a significant increase in translocations is observed. On the other hand, in DNA-PKcs clones harboring DSB clusters with compatible ends, a decrease in translocations is seen after inhibition of Parp1. These results suggest that end processing has an important role in the repair of complex DSB clusters and that this contributes significantly to the formation of translocations. The opposite trend of that seen in DNA-PKcs deficient “R” orientation clones suggests that another pathway besides alt-EJ underpins the formation of translocations – this was indeed confirmed after depletion of Rad52. Ku80 mutation also abrogates c-NHEJ and shows a similar sensitization to killing as the DNA- PKcs mutant “R” orientation clone. But, strikingly Ku80 mutation resulted in a decrease in chromosomal aberration formation from DSB clusters. The effect that was observed in the xrs6 2xS.R11 clone could also be checked in the CHO 2x S.R14 clone and XRC1-3 2xS.R10 clone and the results suggest that while in the DNA-PKcs mutant no additional effect in translocation formation is observed, a decrease is observed in the CHO 2xS.R14 clone. Furthermore cell survival, immunofluorescence and cytogenetics experiments in the CHO clones sustaining simple and complex DSBs suggest that with increasing DSB complexity there is decreased involvement of HRR. Surprisingly chemical inhibition of Rad51 decreased the numbers of translocations in the CHO 2xS.R14 clone, although knockdown generated an increase. Survival experiments conducted with the RAD51 inhibitor BO2 also showed a greater reduction with simple DSBs. Lastly the results presented in this work also show that as compared to simple DSBs, DSB clusters show greater utilization of Rad52 for processing. Rad52 knockdown in clones harboring DSB clusters we see greater decrease than in clones harboring simple DSBs.

Die in dieser Dissertation vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass mit zunehmender DSB-Clusterbildung und damit zunehmender Komplexität des DSBs die Nutzung von CtIP-abhängigen DNA-Prozessierungswegen verstärkt in Anspruch genommen wird. Allerdings können ebenso CtIP-unabhängige DSB-Reparaturwege, die bisher noch nicht charakterisiert wurden, eine Rolle spielen. DSB-Clustering und die damit erhöhte Komplexität von DSBs führt zu einer größeren Abhängigkeit von "fehleranfälligen" DSB-Reparaturwegen wie Alt-EJ und SSA. Vor diesem Hintergrund scheinen das resektionsunabhängige c-NHEJ und die resektionsabhängige und fehlerfreie HRR eine weniger wichtige Rolle bei der Reparatur komplexerer DSB-Cluster zu spielen. Eine verstärkte Beteiligung der HRR an der Reparatur komplexer DSBs, die durch hoch-LET-IR induziert wurden, wurde in der Literatur zwar vorgeschlagen, jedoch noch nicht in biologischen Systemen, in denen definierte Formen komplexer DSBs erzeugt wurden, bestätigt; welche aber in dieser Dissertation genutzt wurden. Eine offensichtliche Diskrepanz in dieser Annahme besteht darin, dass HRR ein fehlerfreier Reparaturpfad ist und damit im Widerspruch zu dem vermehrten Auftreten von Chromosomenaberrationen steht, die sich nach Bestrahlung mit hoch-LET-IR bilden. Es ist daher möglich, dass die HRR, obwohl sie aktiv ist, die Verarbeitung nicht abschließen kann und daher andere, durch Resektion vermittelte fehleranfällige Pfade die beobachteten Translokationen verursachen. Das biologische System, das in dieser Arbeit verwendet wurde, ist ein einzigartiges Werkzeug, mit dem wir „saubere“ DSBs und Cluster von DSBs auf kontrollierte Weise erzeugen können. Die Fülle an Klonen, die uns mit diesen Integrationen zur Verfügung stehen, gibt uns einen vielfältigen Bereich an DSB-Komplexität, der von einfachen DSBs über DSB-Paare bis hin zu DSB-Quadruplets im CHO-Wildtyp und in Mutanten (defizient in DNA-PKcs, Ku80 und XRCC3) reicht. Diese Klone ermöglichen die Untersuchung, welche Reparaturpfade mit zunehmender Komplexität des DSBs in Kraft treten und wie dies das vermehrte Auftreten von chromosomalen Translokationen verursacht. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Experimente sind nachstehend zusammengefasst: Die Hemmung von Parp1-abhängigem alt-EJ führt zu der erwarteten Abnahme der Translokationsbildung, wobei die Abnahme bei Klonen mit DSB-Clustern signifikanter ist. Diese erwartete Abnahme wird bei DNA-PKcs-Klonen mit inkompatiblen DSB-Enden nicht beobachtet, und stattdessen wird eine signifikante Zunahme der Translokationen beobachtet. Andererseits ist in DNA-PKcs-Klonen, die DSB-Cluster mit kompatiblen Enden enthalten, eine Abnahme der Translokationen nach Hemmung von Parp1 zu beobachten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Endverarbeitung eine wichtige Rolle bei der Reparatur komplexer DSB-Cluster spielt und dass dies erheblich zur Bildung von Translokationen beiträgt. Der entgegengesetzte Trend bei dem DNA-PKcs-Klon mit fehlender "R"-Orientierung beobachteten Klon weist darauf hin, dass die Bildung von Translokationen auf einem anderen Weg als auf Alt-EJ beruht - dies wurde in der Tat nach Abreicherung von Rad52 bestätigt. Die Ku80-Mutation inhibiert ebenfalls c-NHEJ und zeigt eine ähnliche Sensibilisierung für das Überleben wie der DNA-PKcs-Mutanten- "R" -Orientierungsklon. Bemerkenswerterweise führte die Ku80-Mutation jedoch zu einer Abnahme der Chromosomenaberrationsbildung aus DSB-Clustern. Der im xrs6 2xS.R11-Klon beobachtete Effekt konnte auch im CHO 2xS.R14-Klon und im XRC1-3 2xS.R10-Klon überprüft werden und die Ergebnisse legen nahe, dass, während in der DNA-PKcs-Mutante kein zusätzlicher Effekt auf die Translokationsbildung beobachtet wird, eine Abnahme derer im CHO 2 × S. R14-Klon beobachtet werden kann. Überdies legen Experimente zum Überleben der Zellen, zur Immunfluoreszenz und zur Zytogenetik in den CHO-Klonen, die einfache und komplexe DSBs ausbilden, nahe, dass mit zunehmender DSB-Komplexität die Beteiligung der HRR abnimmt. Überraschenderweise verringerte die chemische Hemmung von Rad51 die Anzahl der Translokationen im CHO 2xS.R14-Klon, obwohl das genetische Herunterregulieren einen Anstieg bewirkte. Überlebensexperimente, die mit dem RAD51-Inhibitor BO2 durchgeführt wurden, zeigten auch eine stärkere Reduktion mit einfachen DSBs. Schließlich zeigen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse auch, dass DSB-Cluster im Vergleich zu einfachen DSBs eine stärkere Auslastung von Rad52 für die Verarbeitung aufweisen. Wir sehen eine stärkere Abnahme nach Rad52-Knockdown in Klonen, die DSB-Cluster beherbergen als in Klonen, die einfache DSBs beherbergen

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Chaudhary, S., 2020. DSB clusters impair the efficiency of both homologous recombination and c-NHEJ and initiate Rad52 dependent error prone processing. https://doi.org/10.17185/duepublico/71869
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