Modelling Angelman syndrome with patient specific induced pluripotent stem cells

Neureiter, Anika GND

Angelman syndrome (AS) is a rare neurodevelopmental disorder characterized by severe mental retardation, motor disturbances, seizures, hyperactivity, attention deficits and an absence of speech. AS is caused by loss of functional ubiquitin protein ligase E3A (UBE3A) in neurons of the central nervous system. As an E3 ligase, UBE3A participates in the ubiquitin proteasome pathway by binding specific target proteins, which are finally marked by ubiquitination for degradation by the proteasome. Loss of UBE3A activity is thought to result in dysregulation of target proteins, which further interfere with neuron development and function. The UBE3A gene is located in the Prader-Willi syndrome / Angelman syndrome imprinted domain on chromosome 15q11.2-q13. Here, paternal UBE3A expression is silenced in neurons due to expression of the long-non-coding RNA SNHG14, which overlaps the UBE3A gene in antisense. Genetic or epigenetic alterations affecting the maternal UBE3A gene or its expression are sufficient to result in loss of functional UBE3A protein. To date, neither the pathomechanism explaining how missing UBE3A protein leads to symptoms, nor the overall reason for silencing of paternal UBE3A by SNHG14 expression is known. Research on AS is hampered by missing relevant functional human brain tissue. To overcome this limitation and gain insights into the cellular and molecular pathomechanism, we created an in vitro AS model based on neuronal differentiation of patient specific induced pluripotent stem cells (iPSCs). Initially, only one AS-iPSC line, carrying a large chromosomal deletion, was available. Therefore, we reprogrammed dermal fibroblasts from an AS patient carrying a three base pair deletion in the maternal UBE3A gene. Resulting iPSCs were extensively characterized and identified as being pluripotent. A second AS-iPSC line from a patient with an imprinting defect was also generated and tested for genetic and epigenetic integrity and pluripotency. Since paternal UBE3A silencing occurs late during neuron development, an accelerated neuronal differentiation protocol was applied. Neurons expressing TBR1, CUX2 and GAD67 were generated after 50 days of differentiation. During differentiation, silencing of paternal UBE3A was detected. Since UBE3A protein is reported to localize not only in the cytoplasm but also to the nucleus and some target proteins are known to function in regulation of gene expression, gene expression analysis by RNAseq of 50 days old neurons was performed. However, only minor differences between AS- and Ctrl-iPSC-derived neurons were detected, pointing to loss of ligase function as critical parameter for AS. In the future, our AS model will provide the perfect basis to answer open questions contributing to a better understanding of the AS pathomechanism.

Angelman-Syndrom (AS) ist eine seltene neurogenetische Entwicklungsstörung, die u.a. durch eine schwere mentale Retardierung, motorische Störungen, Epilepsie, Hyperaktivität, Aufmerksamkeitsstörungen und durch die Abwesenheit von Sprache gekennzeichnet ist. AS wird durch das Fehlen einer funktionellen E3-Ubiquitin-Ligase, UBE3A, in Neuronen des zentralen Nervensystems hervorgerufen. E3-Ligasen erkenne und binden spezifisch Substratproteine, die ubiquitiniert und somit für den proteasomalen Abbau markiert werden. Es wird angenommen, dass ein Funktionsverlust von UBE3A zu einer Fehlregulation dieser Substratproteine führt, die dann die physiologische Neuronenentwicklung und –funktion stören. Das UBE3A-Gen ist in der geprägten Prader-Willi / Angelman-Syndrom Domäne auf Chromosom 15q11.2-q13 lokalisiert. An diesem Lokus wird die paternale UBE3A Expression durch die in antisense verlaufende Expression der langen, nicht-kodierenden RNA SNHG14 abgeschaltet. Daher reichen Genmutationen oder epigenetische Veränderungen, die das maternale UBE3A-Gen selbst oder dessen Expression betreffen, aus, um zum Verlust eines funktionellen UBE3A Proteins zu führen. Zurzeit sind weder Pathomechanismen bekannt, die erklären wie der Verlust von UBE3A zu den Symptomen führt, noch die grundlegende Ursache für das Stillegen des paternalen UBE3A Allels durch SNHG14-Expression. Das liegt zum Teil daran, dass die Forschung auf diesem Gebiet durch den Mangel an funktionellen humanen Neuronen beeinträchtigt wird. Um diese Hürde zu umgehen und ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Geschehnisse zu erhalten, wurde ein in vitro AS-Modell etabliert, das auf der neuronalen Differenzierung von patientenspezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) beruht. Anfangs war nur eine Zelllinie verfügbar, die eine große chromosomale Deletion trug. Daher wurden dermale Fibroblasten einer AS-Patientin reprogrammiert, die eine drei Basenpaar-Deletion im maternalen UBE3A-Gen tragen. Die generierten iPSCs wurden intensiv charakterisiert und als pluripotent eingestuft. Eine weitere AS-iPSC-Linie einer Patientin, die AS aufgrund eines Imprinting Defekts entwickelte, wurde ebenfalls mit Fokus auf die genetische und epigenetische Integrität und Pluripotenz getestet. Da das Stilllegen der paternalen UBE3A Expression erst spät während der neuronalen Entwicklung geschieht, wurde ein beschleunigtes Differenzierungsprotokoll zur Generierung von kortikalen Neuronen genutzt. Nach einer 50-tägigen Differenzierung entstanden funktionelle TBR1, CUX2 oder GAD67 exprimierende Neurone, die im Verlauf der Differenzierung die paternale UBE3A Expression abschalteten. Da UBE3A in Neuronen nicht nur im Zytoplasma, sondern auch im Zellkern lokalisiert ist und einige Substratproteine an der Regulation der Genexpression beteiligt sind, wurde dieses in vitro Modell genutzt um Genexpressionsanalysen mittels RNAseq an 50-Tage alten Neuronen durchzuführen. Allerdings konnten nur geringe Unterschiede zwischen gesunden und AS-Neuronen detektiert werden. Das deutet darauf hin, dass der Verlust der Ligasefunktion entscheidend für AS ist. In Zukunft können mit diesem in vitro Modell offene Fragen beantwortet werden, die zu einem Verständnis des Pathomechanismus und damit zur Untersuchung neuer Behandlungsansätze beitragen können.

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Neureiter, A., 2019. Modelling Angelman syndrome with patient specific induced pluripotent stem cells. https://doi.org/10.17185/duepublico/70819
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