Das Verhalten virusspezifischer CD8+ T-Zellen und regulatorischer T-Zellen während einer akuten Friend Retrovirus-Infektion in vivo
Chronische virale Infektionen betreffen viele Millionen Menschen weltweit und sind durch eine eingeschränkte adaptive Immunantwort gekennzeichnet. Während der akuten Infektionsphase kontrollieren zytotoxische CD8+ T-Zellen (ZTLs), durch die Abtötung infizierter Zellen, noch sehr effizient die Infektion. Mit fortschreitender Infektionsdauer verlieren diese jedoch zunehmend ihre Funktionalität. Begünstigt wird diese Entwicklung durch regulatorische T-Zellen (Tregs), welche virusinduziert in der späten akuten Infektionsphase expandieren und immunsuppressive Effekte vermitteln. Die zugrundeliegenden Mechanismen der Interaktion zwischen ZTLs und Tregs sind speziell bei retroviralen Infektionen, z.B. mit HIV (humanes Immundefizienzvirus), nur unzureichend aufgeklärt. Aus diesem Grund wurde das gut etablierte Friend Retrovirus (FV)-Mausmodell angewendet um das komplexe Wechselspiel zwischen Tregs und ZTLs, vor der Ausbildung einer chronischen Infektion, mit der Zwei-Photonenmikroskopie in vivo zu untersuchen.
Genutzt wurden DEREG-Mäuse, welche grün fluoreszierende (EGFP) Tregs aufweisen. Die Tiere wurden infiziert und erhielten anschließend einen adoptiven Zelltransfer von nur 1000 FV-spezifischen rot fluoreszierenden (tdTomato) CD8+ T-Zellen. Die transferierten Zellen proliferierten, waren aktiviert und entwickelten antivirale Eigenschaften ohne die natürliche Immunantwort zu verändern. Zusätzlich war die Anzahl an ZTLs optimal für die intravitale Zwei-Photonenmikroskopie der Zellen. ZTLs und Tregs konnten dadurch unter physiologischen Bedingungen im intakten Knochenmark, einem typischen Infektionsherd während der akuten FVInfektion, in lebenden Mäusen mikroskopiert werden. Die Motilität der ZTLs veränderte sich im Verlauf der akuten Infektion und war am stärksten ausgeprägt nach 10 Tagen, dem Zeitpunkt der stärksten ZTL-Funktionalität. In der frühen (Tag 8) und späten (Tag 14) akuten Infektionsphase zeigte sich hingegen eine geringere Beweglichkeit der Zellen. Gegensätzlich dazu wiesen die Tregs eine unveränderte Bewegungsfähigkeit zu allen Zeitpunkten auf. Die suppressiven Effekte der Tregs konnten daher primär auf deren Zellzahl zurückgeführt werden, welche nach 14 Tagen Infektion am höchsten war. Beide Zelltypen interagierten häufig miteinander und bildeten ZellZellkontakte von 2-3 min Dauer. Vor allem in der späten akuten Infektionsphase (14 Tage) reduzierte dies die Motilität der ZTLs, ein Effekt welcher durch eine TregDepletion aufgehoben werden konnte. Dementsprechend beeinflussten die Tregs maßgeblich die Motilität der ZTLs, welche wiederum mit deren Funktionalität korrelierte.
Für ein besseres Verständnis der ZTL-Antwort wurden ebenfalls FV-infizierte Zellen, durch die Nutzung von FV-mWasabi, visualisiert. Im Knochenmark zeigten sich initial (Tag 8) große Cluster grün fluoreszierender FV-infizierter Zellen, welche von ZTLs infiltriert wurden. Die Wasabi+ Zellen wurden vermutlich durch die ZTLs eliminiert, sodass in der späten akuten Infektionsphase (Tag 14) nur vereinzelte infizierte Zellen umgeben von vielen ZTLs sichtbar waren. Für die gleichzeitige Mikroskopie von ZTLs, Tregs und FV-infizierten Zellen wurde ein weiteres modifiziertes FV hergestellt. Genutzt wurde dazu TurboFP650, ein Fluoreszenzprotein im nahen Infrarotbereich, welches optimal mit EGFP und tdTomato kombinierbar ist und eine unterscheidbare Analyse aller drei Zellpopulationen gewährleistet.
Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen Einblick in die Mechanismen der ZTL-TregInteraktion in der lebenden Maus, welche zu der Ausbildung chronischer retroviraler Infektionen beitragen. Dieses Verständnis kann entscheidend für die Entwicklung neuer Treg- oder ZTL-basierter Immuntherapien sein und zusätzlich bei anderen chronischen Infektionen Anwendung finden.
Chronic viral infections affect millions of people worldwide and are characterized by a restricted adaptive immune response. During the acute infection, infected cells are efficiently killed by cytotoxic CD8+ T cells (CTLs). However, these cells lose their functionality when infection progresses. Regulatory T cells (Tregs) that expand after virus infection in the late acute phase promote this process through immunosuppressive effects. The underlying mechanisms of the interaction between CTLs and Tregs are insufficiently clarified, especially for infections with retroviruses like HIV (human immunodeficiency virus). Therefore, the well-established Friend retrovirus (FV) mouse model was applied to investigate the complex interaction between CTLs and Tregs via two-photon microscopy, before viral chronicity is established.
DEREG mice, characterized by green fluorescent (EGFP) Tregs, were used. These animals were infected with FV followed by an adoptive transfer of only 1000 FV-specific red fluorescent (tdTomato) CD8+ T cells. The transferred cells became activated, expanded strongly, and developed anti-viral properties without modifying the endogenous immune response. Additionally, the cell frequency was in an optimal range for intravital two-photon microscopy. Both cell types were imaged in the living mouse under physiological conditions in the intact bone marrow, a typical site of FV infection. The motility of CTLs changed during the acute infection and was most pronounced after 10 days, the time point with the strongest CTL functionality. The early (day 8) and late (day 14) acute phase of infection showed a weaker motility of the CTLs. In contrast, the motility of Tregs was unaltered at all analyzed time points. Thus, the suppressive effects of the Tregs were mainly correlated to their cell number, which was highest after 14 days of infection. Tregs and CTLs showed frequent interactions and formed cell-cell contacts for 2-3 min. In the presence of Tregs the motility of CTLs was reduced, especially during the later phase of infection (14 days), an effect that was abrogated after Treg depletion. Accordingly, Tregs influenced the motility of CTLs, which correlated again with their functionality.For a better understanding of the CTL response, FV-infected cells were also visualized using FV-mWasabi. These cells appeared as large green fluorescent clusters in the bone marrow, which were infiltrated by CTLs, during initial infection (day 8). The Wasabi+ cells were presumably eliminated by the CTLs, so that the FV-infected cells became infrequent and scattered during the later phase of infection (14 days). At the same time many CTLs were present and surrounded the infected cells. For the simultaneous microscopy of CTLs, Tregs and FV-infected cells another modified FV was constructed. The near infrared fluorescent protein TurboFP650 was used for this purpose. TurboFP650 can be combined with EGFP and tdTomato and allows to analyze all three cell populations separately.
The results of this thesis provide insights into the nature of the CTL-Treg interaction in the living mouse that contribute to the development of chronic retroviral infections. This knowledge can be essential for the development of new Treg- or CTL-based immunotherapies, which could be further transferred to other chronic infections.
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