Application of circulating cell-free tumor DNA profiles for therapeutic monitoring and outcome prediction of metastatic melanoma
The implementation of precision oncology requires novel disease and therapy monitoring technologies that are non-invasive, sensitive and specific. Circulating cell-free tumor DNA (ctDNA) reflects the heterogeneous spectrum of specific mutations, especially in systemic disease. Specifically, this thesis aimed to establish and validate plasma-based assays that allow the dynamic quantitative detection of ctDNA as a prognostic biomarker for tumor load and prediction of therapy response in melanoma patients using droplet digital PCR (ddPCR) and next generation sequencing (NGS).
ctDNA monitoring by ddPCR showed excellent sensitivity and high reproducibility. After technical validation of ddPCR with cell line-derived DNA (sensitivity 0.01%), plasma-derived ctDNA was analyzed from a large training cohort (N=96) of advanced stage melanoma patients with assays for the BRAFV600E and NRASQ61 driver mutations as well as TERTC250T and TERTC228T promoter mutations. An independent patient cohort (N=35) was used to validate the clinical utility of ctDNA monitoring under MAPK-targeted or immune checkpoint inhibition therapies.
In contrast, the establishment of an amplicon based NGS protocol in ctDNA samples was hindered by technical issues related to low sensitivity, discrepancies in mutation detection, and poor agreement in mutational status of tumor tissues vs. plasma. In dilution series, using cell line-derived DNA, the lowest limit of detection was 1,000 mutant copies in the background of 10,000 wild-type copies resulting in only 10% analytical sensitivity.
The ddPCR ctDNA results were evaluated with various statistical methods, including ROC and Kaplan Meier analyses, where ctDNA levels were correlated with radiologic treatment response and patient survival. Elevated plasma ctDNA at baseline (i.e. before treatment) was an independent prognostic factor of disease progression when compared with serum S-100 and LDH levels in multivariable analysis (HR 7.43, 95% CI 1.01-55.19, P=0.05). Changes in ctDNA levels during therapy correlated with treatment response. For example, in patients with the BRAFV600E mutation, which drives about half of the melanomas, increasing ctDNA levels were predictive for shorter progression free survival (PFS) (HR 7.28 95% CI 3.64-14.53, P<0.0001), and predicted earlier disease progression compared to routine radiological scans (P<0.05) with a mean lead-time of 3.5 months.
In BRAFV600 patients treated with signaling targeted therapies, the occurrence of secondary NRASQ61 mutation is associated with treatment failure due to therapy resistance. Accordingly, NRAS mutant ctDNA was detected in a significant proportion of samples from patients with BRAF mutant tumors under therapy, but unexpectedly also already at baseline. In vitro sensitivity studies suggested that this represents higher than expected intra-tumoral heterogeneity with pre-existence of small subclones of NRAS-mutated cells. Furthermore, the detection of plasma NRASQ61 ctDNA in baseline samples of MAPKi-treated BRAFV600E patients significantly correlated with shorter PFS (HR 3.18 95% CI 1.31-7.68, P=0.03) and shorter overall survival (OS) (HR 4.08 95%CI 1.57-10.58, P=0.01).
Overall, these results show the potential clinical utility of ddPCR based ctDNA assays as a sensitive monitoring tool, and that ctDNA assessment is a clinically applicable prediction tool for the early assessment of disease progression and therapeutic response in metastatic melanoma patients.
Die Präzisionsonkologie erfordert innovative Methoden zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs von Tumorpatienten und des therapeutischen Ansprechens, die möglichst nicht-invasiv, aber hochsensitiv und -spezifisch sind. Die zirkulierende zellfreie Tumor-DNA (ctDNA) spiegelt hierbei das heterogene Spektrum spezifischer onkogener Mutationen wider, insbesondere bei Patienten im Stadium der Organmetastasierung. Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Etablierung und Validierung von plasmabasierten Messmethoden mittels digital droplet PCR (ddPCR) und next generation sequencing (NGS) zum quantitativen Nachweis von ctDNA und deren Rolle als Biomarker für die Tumorlast und Prädiktion des therapeutischen Ansprechens bei Melanompatienten.
Das ctDNA-Monitoring via ddPCR zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit aus. Nach technischer Validierung der ddPCR an DNA aus Zelllinien (0,01 % Sensitivität), erfolgte die ctDNA-Analyse von Plasmaproben einer großen Patientenkohorte (N=96) mit fortgeschrittenem Melanom mittels spezifischer ddPCR-Assays für BRAFV600E und NRASQ61 Treiber-Mutationen sowie TERTC250T und TERTC228T Promoter-Mutationen. Eine unabhängige Kontrollkohorte (N=35) diente der Validierung der klinischen Anwendbarkeit des ctDNA-Monitoring unter zielgerichteter Therapie mit MAPK- oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren.
Im Gegensatz zur ddPCR war die Etablierung des Amplicon-basierten NGS-Protokolls durch eine sehr geringe Sensitivität und Diskrepanzen im Mutationsnachweis sowie durch eine schwache Korrelation des Mutationsstatus im Tumorgewebe mit dem Mutationsstatus im Plasma gekennzeichnet. In einer Verdünnungsreihe mit DNA aus Zelllinien betrug die untere Nachweisgrenze lediglich 1,000 mutierte DNA-Kopien in einem Hintergrund aus 10,000 Wildtyp-DNA-Kopien, was einer Sensitivität von nur 10% entsprach.
Die Ergebnisse der ddPCR-basierten ctDNA-Analyse wurden mit verschiedenen statistischen Tests, einschließlich ROC- und Kaplan Meier-Analysen, ausgewertet. Hierbei wurden die ctDNA-Spiegel sowohl mit der radiologischen Beurteilung des Therapieerfolges als auch mit der Überlebenszeit korreliert. In der univariaten Analyse erwies sich ein erhöhter ctDNA-Ausgangswert im Plasma (d.h. vor Therapieeinleitung) als unabhängiger prognostischer Faktor für das Fortschreiten der Erkrankung und war deutlich der Bestimmung von S-100 und LDH im Serum überlegen (HR 7.43, 95% CI 1.01-55.19, P=0.05). Veränderungen der ctDNA-Spiegel während der Behandlung korrelierten eindeutig mit dem Therapieansprechen. Bei Patienten mit BRAFV600E Mutation, die bei etwa der Hälfte aller Melanome als Treiber-Mutation fungiert, stellte der ctDNA-Anstieg einen prädiktiven Faktor für ein signifikant kürzeres progressionsfreies Überleben (PFS) dar (HR 7.28 95% CI 3.64-14.53, P<0.0001). Die ctDNA-basierte Erkennung des Tumorprogresses war im Durchschnitt 3,5 Monate früher als radiologische Standarmethoden (P<0.05).
Bei Patienten mit BRAFV600-Mutation, die mit zielgerichteten Therapien behandelt werden, ist das Auftreten von sekundären NRASQ61-Mutationen häufig mit Therapieresistenz assoziiert. Dementsprechend wurde NRAS-mutierte ctDNA auch in unseren Patienten mit BRAF-mutierten Tumoren in einer erheblichen Anzahl der Proben unter Therapie nachgewiesen. Völlig unerwartet jedoch wurde bei einigen Patienten auch bereits vor Therapiebeginn NRASQ61-ctDNA detektiert. In vitro Sensitivitätsstudien ließen vermuten, dass dies auf eine unerwartet hohe intratumorale Heterogenität, sprich der a priori Existenz einzelner NRAS-mutierter Subklone, zurückzuführen ist. Darüber hinaus korrelierte der Nachweis von NRASQ61 ctDNA im Plasma von MAPK-Inhibitor-naiven Patienten mit BRAFV600E-Mutation mit signifikant kürzerem PFS (HR 3.18 95% CI 1.31-7.68, P=0.03) und kürzerer Gesamtüberlebenszeit (OS) (HR 4.08 95%CI 1.57-10.58, P=0.01).
Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse dieser Arbeit den klinischen Nutzen der ctDNA-Bestimmung mit ddPCR als einer hochsensitiven Methode sowohl zur Therapieverlaufskontrolle als auch zur frühzeitigen Beurteilung der Tumorprogression und zur Prädiktion des therapeutischen Ansprechens bei Patienten mit metastasiertem Melanom.