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Identification of novel targets for rational chemoradiotherapy strategies in non-small-cell lung cancer

Kalmbach, Sophie

Lungenkarzinome sind weltweit für die meisten Krebs-assoziierten Todesfälle verantwortlich. Die Mehrheit der Patienten wird mit dem nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (non-small-cell lung cancer, NSCLC) diagnostiziert. Therapie-Modalitäten für Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC umfassen die operative Entfernung des Tumors, Chemotherapie und Strahlentherapie. Dennoch ist die 5-Jahres-Überlebensrate für Patienten mit fortgeschrittenem NSCLC sehr schlecht, da diese Patienten häufig von lokal-begrenztem oder systemischem Rezidiv betroffen sind. Bestrebungen in der translationalen und klinischen Forschung haben zur Entdeckung von sogenannten „driver-Mutationen“ geführt. Diese können sich zwischen verschiedenen NSCLC Subtypen stark unterscheiden und den Erfolg der Therapie beeinflussen. Darauf basierend sind zielgerichtete Therapien ein fester Bestandteil bei der Behandlung von Patienten mit charakteristischen molekularen Veränderungen. Im Gegensatz dazu bezieht die Strahlentherapie die molekulare Heterogenität des Tumors nicht ein. Hypothese dieser Doktorarbeit ist, dass veränderte Signaltransduktionswege einen Einfluss auf die Strahlentherapie in NSCLC haben und dass ein verbessertes Verständnis der zellulären Antworten auf ionisierende Strahlung zur Entwicklung von personalisierten kombinierten Chemo- Strahlentherapie Protokollen beitragen kann. Dazu wurde ein ergebnisoffener, funktioneller, genomischer shRNA Screen durchgeführt um neue Modulatoren der Strahlenantwort zu identifizieren und abschließend zu charakterisieren. Der shRNA Screen hat verschiedene potentielle Kandidaten aufgedeckt die im i) Wnt-Signalweg, ii) Cholin Metabolismus und iii) dem vesikulären Transport von Zellen eine Rolle spielen. Nach initialen Versuchen wurde das SNARE Protein Syntaxin18 (STX18) für eine detaillierte Charakterisierung ausgewählt. Knockdown von STX18 führte zu einer 9 erhöhten Strahlensensitivität in der NSCLC Zelllinie A549 sowohl in Kurzzeit- als auch Langzeit in vitro Versuchen. Diese Ergebnisse unterstützen eine globale Rolle der zellulären Transportmaschinerie in der Antwort auf Stress. Interessanterweise führte eine erhöhte Expression von STX18 durch CRISPR SAM oder einen konventionellen cDNA Vektor nicht zu einer erhöhten Strahlenresistenz in A549 Zellen. Außerdem korrelierte ein Knockdown von STX18 in A549 Zellen in unserem System mit einer Verringerung des mRNA Levels und der enzymatischen Aktivität von MMP9 (Matrix-Metalloproteinase 9). Dies wurde weiterhin mit einer erhöhten Anfälligkeit für Anoikis in vitro in Verbindung gebracht. Ein in vivo Versuch im orthotopen Mausmodell zeigte, dass STX18-knockdown Zellen eine verringerte Fähigkeit besitzen systemische Metastasen zu formen. Zusammenfassend unterstützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass ein Knockdown von STX18 in A549 durch shRNAs die Strahlenantwort in vitro und in vivo moduliert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein im Vorfeld identifizierter Modulator der Strahlenantwort – GADD45B – detaillierter charakterisiert. Kurzzeit-Überlebensversuche bestätigten, dass eine erhöhte Expression von GADD45B vor strahleninduziertem Zelltod in Lungenkrebsmodellen schützt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit ein Grundgerüst für funktionelle Studien von Modulatoren der Strahlenantwort in Lungenkrebsmodellen etabliert. Dies kann zu einem verbesserten Verständnis des Einflusses von spezifischen zellulären Prozessen auf die Strahlenantwort in NSCLC und letztlich zu verbesserten Therapieoptionen für Patienten führen.

Worldwide, lung cancer accounts for most cancer-related deaths. The majority of lung cancer patients is diagnosed with metastatic non-small-cell lung cancer (NSCLC). Treatment modalities include surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Still, 5-year survival rates for patients diagnosed with advanced NSCLC are poor as those patients frequently suffer from localized or systemic relapse. Nevertheless, efforts in translational and clinical research led to the discovery of “driver mutations” that can greatly differ between NSCLC entities and can strongly influence therapy outcome. Based on this, targeted therapies are now a firmly established modality in the treatment of patients harboring characteristic molecular aberrations. In contrast, radiotherapy still does neglect the observed molecular heterogeneity between tumors. In this thesis it was hypothesized that altered signaling transduction pathways can influence the impact of radiotherapy on NSCLC and that an improved understanding of cellular responses to ionizing radiation can pave the way for the development of personalized chemoradiotherapeutic strategies. To this end, an unbiased, functional, genomic shRNA screen was conducted to identify novel modulators of radiation response and to subsequently characterize them. This shRNA screen revealed several targets involved in i) the Wnt-signaling pathway ii) choline metabolism and iii) the vesicular transport machinery. After initial experiments, the SNARE protein Syntaxin18 (STX18) was chosen for in depth characterization. Knockdown of STX18 led to increased radiosensitivity in the NSCLC cell line A549 as shown by short-term and long-term in vitro assays, thus supporting a global role of the cellular transport machinery in the stress response. Interestingly, overexpression of STX18 by either CRISPR SAM or a conventional cDNA vector did not translate into an increased radioresistance in A549 cells. Furthermore, the knockdown of STX18 in A549 correlated with a decrease of mRNA levels and enzymatic activity of MMP9 (matrix metalloproteinase 9). This was further associated with an increased susceptibility to anoikis in vitro. A preliminary in vivo experiment in an orthotopic mouse model revealed reduced formation of distant metastasis in mice injected with STX18 knockdown cells. Altogether, these findings support that the downregulation of STX18 in A549 cells by shRNAs modulates the response to irradiation in vitro and in vivo. In the second part of this thesis, a previously found modulator of the radiation response – GADD45B - was further analyzed. Short-term survival assays confirmed that enhanced expression of GADD45B protects from radiation-induced cell death in lung cancer models. Collectively, in this thesis a framework for functional studies of radiation response modulators of lung cancers was established. This may lead to an improved understanding of the impact of specific cellular processes on the radiotherapy response in NSCLC and eventually to improved patient outcome.

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Kalmbach, Sophie: Identification of novel targets for rational chemoradiotherapy strategies in non-small-cell lung cancer. 2018.

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