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Maßgeschneiderte Affinitätspolymere als Katalysatoren für die Autoproteolyse von Trypsin

Smolin, Daniel

Monomer- und Polymersynthesen Im Rahmen der Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Synthesen von verschiedenen Monomeren erfolgreich war. Die Monomer-Bibliothek wurde um insgesamt drei Monomere erweitert. Mit dem Adamantyl-Monomer 25 steht ein weiterer sehr hydrophober Baustein zur Verfügung, der besonders in kleinere Furchen passt. Das TREN-Monomer 26 ermöglicht die Komplexierung anionischer Liganden und das NBD-Monomer 27 dient als neuer Chromophor-Baustein. Die Steigerung der Ausbeute für das NTA-Monomer 6 konnte nach allen Stufen knapp vervierfacht werden. So war es möglich nun 15.5 % Gesamtausbeute nach allen Stufen zu erreichen. Nach der Monomersynthese folgte die Darstellung von Polymeren zunächst über die im Arbeitskreis etablierte Technik der frei-radikalischen Polymerisation FRP. Diese Technik zeigte sich äußerst robust und lieferte vergleichbare Polymere aus verschiedenen Ansätzen. Die Reproduktion von Polymeren war mithilfe dieser Technik möglich. Der Nachteil dieser Reaktionstechnik ist die fehlende Einstellbarkeit der Polymerlänge und damit auch der Molekularmassenverteilung (PDI 1.35-2.15). In einem weiteren Projekt wurde eine kontrolliert-radikalische Polymerisationstechnik etabliert. Hierbei handelte es sich um die Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP), die eine bessere Kontrolle über die Polymerisationsbedingungen liefert. Allerdings wird bei der klassischen ATRP ein Metallsalz, meist Kupferchlorid, als Katalysator verwendet. Dies macht jedoch die Polymerisation von anionischen Monomeren nahezu unmöglich, da diese das Metallsalz komplexieren und somit dem Katalysezyklus entziehen. Um diesen Umstand zu umgehen, wurde eine andere Variante der ATRP eingesetzt. Bei der Photo-Electron-Transfer ATRP (PET-ATRP) werden anstatt von Metallsalzen photoaktive organische Substanzen eingesetzt, die unter Lichteinstrahlung Radikale bilden, die die Polymerisation vorantreiben. Als erfolgreich dargestellter Photokatalysator, der in der Polymerisation eingesetzt werden konnte, ist Phenylphenothiazin zu nennen. Die Polymerisationen waren erfolgreich und die dargestellten Polymere waren von ihren Eigenschaften nahezu identisch. Die Polydispersitätsindizes waren mit 1.14 bis 1.21 gering, sodass von einer kontrollierten Polymerisation gesprochen werden kann. Die Einstellung der Kettenlänge und damit des Molekulargewichts war nur bedingt möglich, wofür unterschiedliche Ursachen gelten können. Da das verwendete Glas einen Teil der UV-Strahlen absorbieren kann, wurde eine andere Klasse von Photokatalysatoren dargestellt, die auf 5,10-Dihydrophenazin basieren. Die Polymerisationen mit diesen Photokatalysatoren war nun mit sichtbarem Licht möglich und lieferten gut reproduzierbare Polymere mit einer hervorragenden Kontrolle über die Polymerisation, was sich an den niedrigen PDI von 1.19 bis 1.21 zeigt. Inhibition der Serinprotease Trypsin durch Polymere Die Untersuchung der Trypsin-Inhibition erfolgte mit einem sehr robusten Testablauf, der mit unterschiedlichen Puffern und Puffer-Systemen ausgeführt werden kann. Die Assays zeigten das interessantes Phänomen der Substöchiometrie der Trypsin-Inhibition mit Polymeren. Die ermittelten IC50-Werte lagen deutlich unter der 1:1-Stöchiometrie. Dieser Effekt trat mit zunehmender Inkubationszeit verstärkt auf, die benötigte Stoffmenge an Polymer, welche nötig ist um 50 % der vorhandenen Enzyme zu inhibieren, nahm weiter ab. Mithilfe der CD-Spektroskopie konnte belegt werden, dass Trypsin eine Konformationsänderung in Gegenwart von Polymer durchläuft. Innerhalb von fünf Minuten ist die charakteristische Trypsin-Bande verschwunden. Diese Konformationsänderung war auch bei der Trypsin-Inkubation ohne Polymer zu beobachten, allerdings zu wesentlich späteren Zeiten als mit Polymer (~30 min). Die Änderung der Konformation von Trypsin ist auf die autolytische Aktivität dessen zurückzuführen, es ist sein eigenes Substrat. In weiteren Analyseverfahren wurde die Gelfiltration und Gelelektrophorese eingesetzt um, einen tieferen Einblick in die entstehenden Fragmente zu erhalten. Für die Gelfiltration war es zunächst unabdingbar, die geeigneten Elutionsbedingungen zu finden, mit der eine Auftrennung der Spaltprodukte möglich ist. Die Chromatogramme zeigten eine Abnahme der Signalintensität des Trypsin-Signals, während gleichzeitig die Intensität von Peptiden im Bereich von etwa 1 bis 12 kDa anstieg. Die Gelelektrophorese (SDS-PAGE) lieferte ähnliche Ergebnisse. Sie zeigten eine deutliche Beschleunigung der Fragmentbildung in Gegenwart von Polymer. Aufgrund dessen kann auf eine Erhöhung der autokatalytischen Aktivität geschlossen werden, die durch das Polymer katalysiert wird. Die Ergebnisse der nativen Massenspektrometrie zeigen ebenfalls eine beschleunigte Autoproteolyse des Enzyms in Gegenwart von Polymer P1. Die isotherme Titrationskalorimetrie jedoch zeigte keine bestimmbare Wärmetönung einer Trypsinogen-Polymer-Komplexbildung. Alle analytischen Verfahren und Methoden deuten in dieselbe Richtung, dass das Polymer die lokale Konzentration von Trypsin erhöht und damit die Wahrscheinlichkeit der Substratfindung ebenfalls deutlich erhöht, sodass die Trypsin-Moleküle sich gegenseitig am Polymer hydrolysieren.

A major complication in pancreatitis, ischemia and cardiac surgery is the enzymatic self-digestion of the gastrointestinal walls. Most digestive enzymes are serine proteases, thus can be generally blocked by unspecific inhibitors such as aprotinin. However, the downsides of such inhibitors are the need of a stoichiometric amount, and the unwanted side-effect to other enzymes (e.g. in blood clotting). An alternative substance class of selective serine protease inhibitors are high-affinity polymers, which carries amino acid-selective side chains. In comparison to the conventional serine protease inhibitors, these polymers show ability to recognize the surface of a given enzyme allowing a highly specific and, in some cases, particularly substoichiometric inhibition. The aim of this thesis was to investigate such polymer-based enzyme specific inhibitors and the synthesis of more precise high-affinity polymers via controlled polymerization protocols. The special scope laid on Trypsin due to its ability to activate the other pancreatic digestive enzymes. Syntheses of monomers and polymers Within the scope of this thesis the successful synthesis of different monomers could be shown allowing an expansion of existing library by additional three monomers. The Adamantyl monomer 25 is a highly hydrophobic building block that particularly suitable for smaller grooves. TREN monomer 26 enables the complexation of anionic ligands and NBD monomer 27 serves as a new chromophore building block. A modification of the synthetic procedure for the NTA monomer increased the overall yield by a factor of four resulted in 15.5% yield of final compound. The polymer syntheses were carried out using the well-established technique of free radical Polymerization (FRP). This technique was extremely robust, the different batches were comparable to their chemical and physical properties. The disadvantage of this reaction type is the lack of adjustability of polymer length and molecular mass distribution leads to higher polydispersity indices (PDI 1.35-2.15). To overcome the disadvantage of FRP a controlled radical polymerization technique was established in another project. The so-called Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) provides a better control over the polymerization conditions, which is crucial for low PDI and adjustment of polymer length. However, the use of metal catalyst (e.g. cooper chloride) in classical ATRP is not applicable for a polymerization of anionic monomers due to the formation of metal-monomer complexes. Therefore, another variant of ATRP, the photo-electron transfer ATRP (PET-ATRP) was use for the polymerization. This method employs photoactive organic substances instead of metal salts to form radicals under light irradiation hence promote the polymerization. An example of such catalysts, the 10-phenylphenothiazine and 5,10-dihydrophenazine, could be successfully synthesized and employed for polymerization. The polymers catalyzed by 10-phenylphenothiazine shown almost identical properties, giving rather low PDI between 1.14 to 1.21, so that a controlled polymerization can be mentioned. The other class of photocatalysts based on 5,10-dihydrophenazine allowed polymerization with visible light and proved highly reproducible polymers with excellent control, as evidenced by the low PDI of 1.19 to 1.21. Inhibition of protease Trypsin by polymers The trypsin inhibition was investigated using a very robust test procedure that can be performed with various buffers and buffer systems. The assays showed the interesting phenomenon of substoichiometric trypsin inhibition with polymers. This effect increased with longer incubation time and the amount of polymer required to inhibit 50 % of the existing enzymes decreased further. CD spectroscopy has shown that trypsin undergoes a conformational change in the presence of polymer. Within five minutes, the characteristic cotton bands of trypsin was no longer observable. Furthermore, this conformational change was also detected in trypsin incubation without polymer, however later than the sample with polymer (~30 min). The change in the conformation of trypsin is due to its autolytic activity. In further analytical studies/experiments by gel filtration and gel electrophoresis were approached to obtain a deeper insight into the resulting fragments. For gel filtration, it was initially essential to find the appropriate elution conditions with which the cleavage products could be separated. The chromatograms showed a decrease in the signal intensity of the trypsin signal, while at the same time the intensity of peptides increased in the range of about 1 to 12 kDa. Gel electrophoresis (SDS-PAGE) provided comparable results featuring a significant acceleration of fragment formation in the presence of polymer. This leads to an increase in the autocatalytic activity catalyzed by the polymer. As a result, all experiments pointed in the same conclusion: The polymer enhances the local concentration of trypsin thus significantly increases the probability of finding the substrates. This situation supports the self-hydrolyzation of trypsin molecules on the polymer surface.

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Smolin, Daniel: Maßgeschneiderte Affinitätspolymere als Katalysatoren für die Autoproteolyse von Trypsin. 2018.

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