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Innovative approaches to the detection of HLA immune escape in leukemia relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation

Relapse of malignant disease is the most frequent cause of treatment failure in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), often due to selective genomic loss of the mismatched human leukocyte antigens (“HLA loss”). The diagnosis of this condition is relevant for adopting appropriate treatment strategies and assessing its relevance in different transplant settings, but is precluded by technical challenges associated with the extreme polymorphism in HLA. The aim of the present thesis was to close this gap by 1) investigating the clinical utility of quantitative PCR (qPCR) for chimerism monitoring after HSCT; 2) developing HLA-specific qPCR assays to detect HLA loss relapse; and 3) establishing new next generation sequencing (NGS) protocols for the high throughput detection of HLA loss relapse. In the first aim, published in Ahci et al., Biol Blood Marrow Transplant 2017, we retrospectively tested chimerism after 30 allo-HSCT at UK-Essen, in parallel by standard short tandem repeat (STR) and a new commercial qPCR method targeting insertion-deletion polymorphisms outside HLA. We demonstrated a 1-log higher sensitivity of qPCR, resulting in clinical utility for early relapse detection and other clinical endpoints including engraftment. These results led to a diagnostic shift from STR to qPCR for the follow-up of allo-HSCT at UK-Essen. In the second aim, published in Ahci & Toffalori et al., Blood 2017, we developed qPCR chimerism for single nucleotide polymorphisms within the HLA system, providing a user-friendly, robust and sensitive method for the detection of HLA loss relapse which combines chimerism outside and inside HLA in a single “HLA-KMR” system under industrial sponsorship and commercialization. In the third aim, we developed NGS-based HLA typing in collaboration with the DKMS Life Science Lab leader in the field, adapted this approach to the detection of HLA chimerism and applied it to 34 relapses after unrelated donor HSCT at UK-Essen. This allowed us to identify at least one HLA loss relapse occurring after partially HLA mismatched HSCT, further substantiating the clinical relevance of HLA loss as mechanism underlying relapse. Taken together, the data from my thesis set the stage for further analyses regarding the incidence and risk factors of HLA loss relapse in different transplant contexts through national and international collaborations, and the investigation of somatic neo-mutations in HLA as a new mechanism of immune escape after cancer immunotherapy.

Die häufigste Ursache des Therapieversagens der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (allo-HSZT) zur Behandlung bösartiger Bluterkrankungen sind Krankheitsrückfälle, welch häufig durch den genomischen Verlust der patienten-spezifischen HLA Gewebeantigene gekennzeichnet sind („HLA Verlust“). Die Diagnose dieses gezielten Immunevasionsmechanismus ist aufgrund der großen Variabilität des HLA Systems mit erheblichen technischen Schwierigkeiten verbunden, obwohl sie von großer klinischer und wissenschaftlicher Bedeutung wäre. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, diese Lücke zu schließen und durch 1) Untersuchung des klinischen Vorteils der Chimärismusbestimmung nach HSZT mittels quantitativer PCR (qPCR); 2) Entwicklung von HLA-spezifischen qPCR Reaktionen zur Erkennung des HLA Verlust Rückfalls; 3) Aufbau von next generation sequencing (NGS) zur Hochdurchsatzbestimmung von HLA Verlust Rezidiven. Für das erste Ziel, veröffentlicht in Ahci et al., Biol Blood Marrow Transplant 2017, wurden 30 allo-HSZT vom UK-Essen vergleichend mit der Standardmethode short tandem repeat (STR) und einem neuen kommerziellen qPCR Ansatz auf Chimärismus getestet. Die höhere Sensitivität der qPCR war klinisch für die Beurteilung von Rezidiven und anderen klinischen Endpunkten von Vorteil und wird seither routinemäßig am UK-Essen eingesetzt. Für das zweite Ziel, veröffentlicht in Ahci & Toffalori et al., Blood 2017, wurden qPCR Reaktionen für eine Anzahl von HLA Allelen entwickelt um eine nutzerfreundliche, robuste und sensitive Methode zur Erkennung von HLA Verlust Rezidiven zu erstellen, welche als „HLA-KMR“ industrielle Verwertung gefunden hat. Für das dritte Ziel wurde eine NGS Plattform zur HLA Typisierung in Kooperation mit dem DKMS Life Science Lab entwickelt, auf den HLA Chimärismus adaptiert und anhand von 34 Rückfallproben von am UK-Essen transplantierten Patienten getestet. Selbst in dieser limitierten Kohorte wurde mindestens ein HLA Verlust Rezidiv nach partiell HLA differenter HSZT entdeckt, was die klinische Relevanz dieses Immunevasionsmechanismus unterstreicht. Die in dieser Doktorarbeit erzielten Resultate werden nun die Untersuchung der Inzidenz und Risikofaktoren von HLA Verlustrezidiven nach allo-HSZT in großen nationalen und internationalen Studien ermöglichen. Zudem wird die NGS Plattform zur Analyse von somatischen HLA Neomutationen als potentiellem neuen Immunevasions-mechanismus nach Tumorimmuntherapie genutzt werden.

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Innovative approaches to the detection of HLA immune escape in leukemia relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. 2018.

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