Genetics of thyroid cancer and effects of thyroid hormone on tumor progress in vivo

Latteyer, Sören GND

Thyroid cancer is the most prevalent endocrine tumor but represents only 1% of all malignant tumors. Thyroid cancer can be classified according to the underlying altered cell type, morphology and pathology. Most of the thyroid carcinomas are differentiated (>80%) and have an excellent prognosis whereas patients with a poorly differentiated thyroid carcinoma (<5%) have a rather unfavorable prognosis. A small minority (<5%) of the thyroid carcinomas shows a rapid progression with poor prognosis and a median survival time of only 4 to 6 months. This so-called anaplastic thyroid carcinoma is extremely rare and is characterized by a high rate of mitosis, invasive growth, refractory against radioiodine, and an extreme heterogeneity in the genetic landscape. Furthermore, no improvement in the treatment of patients with anaplastic thyroid carcinoma has been achieved over the last 50 years. Based on the morphology, these tumors originate from the thyrocytes of the thyroid gland and dedifferentiate to a loss of the ability to store iodine as it is the case with the anaplastic thyroid carcinoma. On molecular biology level, this observation is explained by an accumulation of mutations in different genes. In order to understand the poor course and the difficult treatment of the anaplastic thyroid carcinoma, the genetic landscape was investigated and characterized in tumor tissue of 39 anaplastic thyroid carcinoma patients by next-generation sequencing. In 90% of the samples, at least one mutation and, in 57% at least two mutations of the tested genes were found: TP53 (18/30), NF1 (11/30), ALK (6/30), NRAS (4/30), ATRX (3/30), BRAF (2/30), HRAS (2/30), KRAS (1/30). The data confirm the genetic heterogeneity of the anaplastic thyroid carcinoma and show that the anaplastic thyroid carcinoma should not necessarily be treated as a single entity. It could therefore be useful to divide the patients into subgroups regarding the underlying mutation and treat them by targeted therapy. The thyroid carcinomas mentioned above all arise from the thyrocytes of the thyroid gland. The situation is different in the case of medullary thyroid carcinoma which does not develop from the thyrocytes but from the C-cells of the thyroid gland. The medullary thyroid carcinoma occurs in approximately 25% of cases hereditary as multiple endocrine neoplasia type 2 A and B. This is caused by mutations in the hotspots of the proto-oncogene RET. A patient with clinical symptoms of MEN2A and an unusual constellation of bilateral pheochromocytoma followed by a medullary thyroid carcinoma will be discussed in this thesis. In spite of several genetic routines according to the current guidelines at that time, no mutation could be found. By means of whole exome sequencing, a mutation was found in the proto-oncogene RET (c.1512_1517delGGAGGG, p.505_506del), an exon which is usually not associated with MEN2A. In order to investigate the pathogenic property of this mutation, the RET variant was generated by mutagenesis and compared to RET9 wildtype in cell biology experiments. Immunoblotting revealed an (auto-) phosphorylation of RET9, enhanced activation of the MAPK/ERK, and the PI3K/AKT signaling pathway in the RET9 p.505_506del compared to RET9 wildtype. Luciferase assay confirmed ERK1/2 activation. Colony formation assay confirmed a significant selection and proliferation advantage over RET9 wild-type expressing cells. The genetic analysis of the parents and siblings showed that no other family member is affected and this mutation originated de novo. Although molecular diagnostics were carried out according to the current guidelines, no RET mutation could be found. This case shows that the guidelines were insufficient and were adapted after the publication of the case report. The guidelines now indicate that the complete RET sequence should be analyzed in MEN2 patients without genetic findings after routine diagnosis. Thyroid hormones are important but may be harmful in certain situations. Studies show that hyperthyroidism increases tumor growth. The mechanism behind this observation is not understood. This question is clinically relevant in the use of modern targeted tyrosine kinase inhibitors, since these can cause hypothyroidism as a side effect, which is compensated by thyroid hormone. To answer this question, hypothyroidism was induced in immunocompetent C57B6(Cg)-Tyrc-2J mice followed by an intrapulmonary injection of Lewis Lung Cell Carcinoma. The animals were treated with T3, T4 and/or 3,3',5,5'-tetraiodothyroacetic acid (Tetrac). By means of in vivo imaging, the tumor growth was analyzed over time as well as the tumor weight at the end of the experiment. The administration of T4, not T3, results in a significant increase in tumor weight as well as bioluminescence but was gone in the presence of the integrin αvβ3 inhibitor Tetrac. Flow cytometric analyses showed no change in the composition of infiltrating immune cells. However, immunohistochemical analyzes of the tumor samples showed a significantly enhanced formation of blood vessels (CD31+) in T4 treated animals, which was abolished in the presence of Tetrac. The results suggested that the tumor-promoting effect is mediated exclusively by T4, not T3, to the integrin αvβ3 and is probably promoted to neoangiogenesis.

Schilddrüsenkarzinome sind die häufigsten bösartigen endokrinen Tumore und repräsentieren 1% der malignen Tumorentitäten. Sie lassen sich entsprechend des zugrundeliegenden Zelltyps, Morphologie und Pathologie klassifizieren. Die Mehrheit der Schilddrüsenkarzinome sind differenziert (>80%) und haben eine exzellente Prognose wohingegen Patienten mit einem gering differenzierten Schilddrüsenkarzinom (<5%) eine eher ungünstigere Prognose haben. Eine weitere kleine Minderheit (<5%) der Schilddrüsenkarzinome zeigt einen rasch progredienten Verlauf mit häufig infauster Prognose bei Diagnose und einer medianen Überlebenszeit von lediglich 4 bis 6 Monate. Dieses sogenannte anaplastische Schilddrüsenkarzinom ist äußerst selten und durch eine hohe Mitoserate, invasives Wachstum, Refraktärität gegenüber Radiojod und eine äußersten Heterogenität auf genetischer Ebene gekennzeichnet. In den letzten 50 Jahren konnte keine signifikante Verbesserung der Behandlung erzielt werden. Morphologisch entspringen die erwähnten Tumore alle aus den Thyreozyten der Schilddrüse und dedifferenzieren bis zu einem Verlust der Fähigkeit Jod zu speichern wie es der Fall beim anaplastischen Schilddrüsenkarzinom ist. Molekularbiologisch ist dies durch eine Akkumulation von Mutationen in unterschiedlichsten Genen zu erklären. Um den schlechten Verlauf und die schwierige Behandlung des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms besser verstehen zu können, wurde Tumorgewebe von 39 anaplastischen Schilddrüsenkarzinom Patienten mittels zielgerichteter Next-Generation Sequencing untersucht. In 90% der Proben wurden mindestens eine und in 57% Proben mindestens zwei Mutationen der untersuchten Gene gefunden: TP53 (18/30), NF1 (11/30), ALK (6/30), NRAS (4/30), ATRX (3/30), BRAF (2/30), HRAS (2/30), KRAS (1/30). Die Daten bestätigen die genetische Heterogenität im anaplastischen Schilddrüsenkarzinom und legen nahe, dass das anaplastische Schilddrüsenkarzinom möglicherweise nicht als eine einzige Entität behandelt werden sollte. Es könnte daher durchaus sinnvoll sein, Patienten nach der zugrundeliegenden Mutation in Untergruppen zu unterteilen und zielgerichtet für diese Mutationen zu behandeln. Die bereits erwähnten Schilddrüsenkarzinome entstehen alle aus den Thyreozyten der Schilddrüse. Anders verhält es sich beim medullären Schilddrüsenkarzinom, welches sich nicht aus den Thyreozyten, sondern aus den Calcitonin-produzierenden C-Zellen der Schilddrüse entwickelt. Das medulläre Schilddrüsenkarzinom tritt in 25% der Fälle hereditär im Rahmen einer Multiplen Endokrinen Neoplasie Typ 2 A und B auf. Ursächlich sind Mutationen in den Hotspots des Protoonkogenes RET. Eine Patientin mit klinischen Symptomen einer MEN2A Erkrankung und einer außergewöhnlichen Konstellation eines zuerst aufgetretenen bilateralen Phäochromozytom gefolgt von einem medullären Schilddrüsenkarzinom wurde in dieser Arbeit untersucht. Trotz mehrfacher genetischer Routinediagnostik, nach den Standards des damaligen Zeitpunktes, in den bekannten Hotspots des Protoonkogenes RET konnte keine zugrundeliegende Mutation gefunden werden. Mittels Whole Exomsequencing wurde dennoch eine Mutation außerhalb der Hotspots des Protoonkogene RET (c.1512_1517delGGAGGG, p.505_506del) gefunden. Um die pathogene Eigenschaft dieser Mutation zu untersuchen wurde per Mutagenese diese RET-Variante generiert und in zellbiologischen Experimenten mit RET9 Wildtyp verglichen. Mittels Immunoblotting zeigte sich eine (Auto-)phosphorylierung von RET9, ferner eine verstärkte Aktivierung des MAPK/ERK und PI3K/AKT-Signalwegs in der RET9 p.505_506del verglichen mit RET9 Wildtyp. Ein Luciferase-Assay bestätigte die ERK1/2 Aktivierung. Colony Formation Assay zeigte einen signifikanten Selektions- und Proliferationsvorteil gegenüber RET9 Wildtyp exprimierenden Zellen. Die genetische Analyse der Eltern und Geschwister bestätigte, dass kein weiteres Familienmitglied betroffen ist und diese Mutation de novo entstanden ist. Obwohl bei der molekularen Diagnostik nach den zu dem Zeitpunkt aktuellen Leitlinien vorgegangen wurde, konnte keine RET Mutation gefunden werden. Dieser Fall zeigt, dass die Leitlinien nicht ausreichend waren. Nach Veröffentlich des Fallberichts wurden die Leitlinien angepasst und besagen jetzt, dass bei Patienten mit MEN2 ohne genetischen Befund nach Routinediagnostik die komplette RET Sequenz analysiert werden soll. Schilddrüsenhormone sind wichtig, können aber eventuell in bestimmten Situationen schädlich sein. Studien zeigen, dass eine Hyperthyreose das Tumorwachstum beschleunigt. Der Mechanismus hinter dieser Beobachtung ist noch weitgehend unbekannt. Um dieser Frage nachzugehen wurde in immunkompetenten C57B6(Cg)-Tyrc-2J Mäusen eine Hypothyreose induziert gefolgt von einer intrapulmonalen Injektion von Lewis Lung Cell Carcinoma. Die Tiere wurden anschließend mit T3, T4 und/oder 3,3′,5,5′-Tetraiodothyroacetic acid (Tetrac) behandelt. Mittels in vivo imaging wurde das Tumorwachstum über die Zeit analysiert, sowie das Tumorgewicht am Versuchsende. Die Gabe von T4, nicht T3, führt zu einem signifikanten Anstieg des Tumorgewichts sowie der Biolumineszenz und wurde in Gegenwart des Integrin (αvβ3) Inhibitor Tetrac aufgehoben. Durchflusszyometrische Analysen zeigten keine Änderung der Zusammensetzung von infiltrierenden Immunzellen. Immunhistochemische Analysen der Tumorproben zeigten jedoch eine signifikante Neubildung von Blutgefäßen (CD31+) in T4 behandelten Tieren, welche in Gegenwart von Tetrac nicht beobachtet wurde war. Die generierten Ergebnisse legen nahe, dass der tumorfördernde Effekt ausschließlich von T4, nicht T3, über das Integrin αvβ3 vermittelt wird und wahrscheinlich fördernd auf die Neoangiogenese ist.

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Latteyer, Sören: Genetics of thyroid cancer and effects of thyroid hormone on tumor progress in vivo. 2019.

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