Role of Heparan sulfate in Indian Hedgehog signaling and Glycosaminoglycan composition
Indian hedgehog (Ihh), which belongs to the conserved family of Hedgehog proteins, is one of the key regulators of embryonic bone development. Several lines of evidence indicate that the distribution and activity of Ihh in the cartilage tissue are dependent on the extracellular matrix (ECM) composition and, particularly, on the level and sulfation pattern of Heparan sulfate (HS) (Dierker et al., 2016; Koziel et al., 2004; Ratzka et al., 2008; Yasuda et al., 2010).
This work investigates the properties of the HS-Ihh interaction and the role of HS in the multimerization of Ihh. Moreover, the changes in GAG composition of mice with an altered HS structure were analyzed.
In the closely related Sonic Hedgehog (Shh), two conserved HS-binding sequences, called Cardin-Weintraub (CW) motifs, which support a direct interaction with HS, have been proposed. (Chang et al., 2011; Farshi et al., 2011; Ohlig et al., 2011; Whalen et al., 2013). The current work demonstrates that Ihh, like Shh, also contains two CW motifs (CW1 and CW2). Both domains are highly conserved, but the CW1 sequence is not identical between Shh and Ihh.
Mutation analysis revealed that the binding of Ihh, expressed in HEK-293Ebna cells to HS is mediated by both motifs, which, however, interact to specifically sulfated HS in distinct manners. Moreover, analysis of the Ihh multimerization showed that the CW1 and CW2 domains are essential, but–correlating with their HS affinity–distinctly important for multimer formation.
Surprisingly, analysis of the role of the HS modification pattern on the binding affinity of Shh and Ihh showed that loss of N-sulfation leads to an increased affinity of both proteins. 2-Osulfate deficient HS bound Ihh with similar, but Shh with higher affinity than wild type HS. To better understand how the differences between the Shh and Ihh CW1 sequences impact their HS binding, the affinities of the two paralogs to HS were compared. By exchanging the HS-interacting regions, this work demonstrates that these variations result in distinct affinities to HS and multimer size of the paralogous proteins.
Although the interaction with HS seems to mediate the Ihh multimerization in HEK-293Ebna cells, no alterations in multimer size were observed for Ihh expressed in primary chondrocyte of mouse mutants with an altered HS structure. This indicates that another cartilage glycosaminoglycan partly compensates for the HS functions. In line with this, analysis of E16.5 cartilage by immunofluorescence staining indicated that in mice, deficient in HS synthesizing (Ext1gt/gt) or modifying enzymes (Ndst1-/-; Hs2st-/- and Sulf1gt/gt;Sulf2gt/gt), the altered HS was compensated by changes in the levels of Chondroitin sulfate (CS), the main sulfated glycosaminoglycans in chondrocytes. This finding was confirmed by disaccharide analysis of HS and CS purified from Ext1gt/gt and Hs2st-/- embryonic skeletons. Moreover, evaluating the chain length of GAGs, produced by primary chondrocytes revealed that the decreased HS levels in Ext1gt/gt mice resulted in more, but shorter CS chains, while Hs2st-/- cells compensated the altered HS sulfation pattern by an increase of cell surface-associated HS and an elongation of CS chains carried by secreted proteoglycans.
Taken together, these data indicate that the interactions of Ihh with HS are determined by two motifs of positively charged residues. Each motif likely interacts with specifically sulfated HS, and possibly with CS. In addition, these data demonstrate for the first time that not only reduced levels, but also an altered HS structure leads to an increase in CS levels. This underlines the highly adaptable nature of ECM and strongly points to a functional overlap between HS and CS in regulating signaling molecules during bone development.
Indian Hedgehog (Ihh), welches zur konservierten Familie der Hedgehog Proteine gehört, ist einer der Hauptregulatoren der embryonalen Knochenentwicklung. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Verteilung und Aktivität von Ihh von der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM), insbesondere von der Menge und dem Sulfatierungsmuster von Herparansulfaten (HS) reguliert wird (Dierker et al., 2016; Koziel et al., 2004; Ratzka et al., 2008; Yasuda et al., 2010).
In dieser Arbeit wurden die HS-Ihh Wechselwirkungen und der Einfluss von HS auf die Multimerisierung von Ihh untersucht. Außerdem wurde anhand von Maus-Mutanten, bei denen verminderte HS-Level oder Sulfatierungstufen vorlagen, ein potenzieller Effekt auf die Zusammensetzung der ECM analysiert.
Bei dem Ihh Paralog Sonic Hedgehog (Shh) wurden zwei konservierte HS-Bindungsdomänen beschrieben, die sogenannten Cardin-Weintraub (CW) Motive, die eine direkte Interaktion mit HS vermitteln. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Ihh Protein beide Motive (CW1 und CW2) aufweist. Diese Motive sind hoch konserviert, trotzdem gibt es Unterschiede zwischen den CW1 Sequenzen von Shh und Ihh.
Mittels Mutationsanalysen wurde gezeigt, dass Ihh, welches in HEK-293Ebna Zellen exprimiert wurde, über die beiden CW-Motive mit HS interagiert. Dabei interagiert jedes Motiv mit spezifisch sulfatiertem HS mit unterschiedlicher Affinität. Darüber hinaus zeigten weitere Analysen, dass die CW1 und CW2 Domänen essentiell für die Ihh Multimerisierung sind und diese von der HS-Affinität abhängt.
In weiteren Analysen wurde die Bedeutung des HS-Sulfatierungsmusters für die HS-Hh Interaktion untersucht. Interessanterweise zeigte HS mit verringerter N-Sulfatierung im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte Affinität zu Ihh und Shh. 2-O-Sulfat defizientes HS weist hingegen eine erhöhte Affinität zu Shh, aber eine unveränderte Affinität zu Ihh auf. Um die Unterschiede in den CW1-Sequenzen von Shh und Ihh und deren Einfluss auf die Interaktion mit HS besser verstehen zu können, wurde deren Affinität zu HS untersucht. Durch den Austausch ihrer CW1 Motive konnte gezeigt werden, dass die Protein-spezifische HS-Affinität und die Multimergröße durch dieses Motiv bestimmt wird.
Obwohl die Interaktion mit HS die Bildung von Ihh-Multimeren in HEK-293Ebna-Zellen vermittelt, konnte in primären Chondrozyzen aus Maus-Mutanten mit veränderter HSStruktur kein Einfluss auf die Multimergröße festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten drauf hin, dass ein anderes Glykosaminoglykan die Funktion von HS im Knorpel teilweise kompensieren kann. Einen ersten Hinweis darauf lieferten Immunfluoreszenz-Analysen von E16.5 Gliedmaßen von Maus-Mutanten mit einer Defizienz für Enzyme, die an der HSSynthese (Ext1gt/gt) oder Modifikation (Ndst1-/-; Hs2st-/- und Sulf1gt/gt;Sulf2gt/gt) beteiligt sind. Die resultierenden HS-Veränderungen wurden durch ein erhöhtes Level an Chondroitinsulfat (CS) kompensiert. Diese Ergebnisse konnten mittels Disaccharid-Analysen von HS und CS aus embryonalen Skeletten von Ext1gt/gt und Hs2st-/- Mutanten bestätigt werden.
Eine Analyse der GAG-Kettenlänge zeigte, dass in primären Chondrozyten von Ext1gt/gt Mäusen das verminderte HS Level in einer erhöhten Menge an kürzeren CS Ketten resultiert. Bei Hs2st-defizienten Zellen wurde dagegen das veränderte HS-Sulfatierungsmuster durch eine gesteigerte Menge von Zelloberflächen-assoziiertem HS, sowie einer Verlängerung der in die ECM sezernierten CS-Ketten kompensiert.
Zusammenfassend zeigen die Daten, dass die Interaktion von Ihh mit HS über die positiv geladenen Aminosäuren in den zwei konservierten Bindungsdomänen vermittelt wird. Jede Bindungsdomäne interagiert dabei mit unterschiedlicher Affinität mit spezifisch sulfatiertem HS und möglicherweise auch mit CS. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass nicht nur verringerte HS-Level, sondern auch ein verändertes Sulfatierungsmuster zu einer gesteigerten Menge an CS führen kann. Diese Beobachtung unterstreicht die hohe Kompensationsfähigkeit der Knorpel-ECM hinsichtlich der Zusammensetzung der GAGs und weist auf funktionale Wechselwirkungen zwischen HS und CS in der Regulation von Signalmolekülen während der Knochenentwicklung hin.
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