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Evaluierung Blut- und Gewebebasierter Biomarker beim Ovarialkarzinom

Chebouti, Issam

Trotz fortgeschrittener Behandlungsmöglichkeiten beträgt die Rezidivrate beim Ovarialkarzinom etwa 75%, wobei 15-20% der Patientinnen platinresistent sind, was bisher nur retrospektiv erkannt wird. Somit ist dem Ovarialkarzinom eine sehr schlechte Prognose zuzuordnen und es ist von großem Interesse, innovative, blutbasierte Biomarkerkonzepte zu entwickeln, die uns Aufschluss über Prognose, Rezidiventwicklung, Therapieansprechen geben oder im Therapieverlauf genutzt werden können. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zirkulierende Tumorzellen im Blut und disseminierte Tumorzellen im Knochenmark sowie zirkulierende DNA und microRNAs, vor und nach Therapie, als potentielle Biomarker evaluiert. Durch Etablierung einer Vierfach-Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis LIN-28pos und/oder SOX-2pos Tumorzellen mit Stammzellcharakter im Knochenmark konnte die Präsenz dieser Zellen, sowohl vor als auch nach Chemotherapie, nachgewiesen werden. Dabei wurden sowohl epitheliale, als auch Tumorstammzellen ohne epithelialen Charakter detektiert, was die Vermutung nahe legte, dass sich einige dieser Zellen in Epithelialer-Mesenchymaler-Transition befanden, während epitheliale Tumorzellen mit Stammzellcharakter keine Umwandlung durchliefen oder den mesenchymalen Charakter wieder verloren hatten. Der mesenchymale Phänotyp konnte auch durch Untersuchungen an zirkulierenden Tumorzellen belegt werden, deren Prozentsatz dominierte und unter Therapie noch um 20% zunahm. Interessanterweise entwickelte sich unter Therapie ein PI3K/Twistpos Phänotyp, der vor Therapie nicht identifiziert wurde. Neben dem mesenchymalen- und Stammzellcharakter der zirkulierenden Tumorzellen konnte aber auch die Präsenz und Persistenz resistenter, ERCC1pos zirkulierender Tumorzellen belegt werden, wobei die Präsenz dieser Zellen mit einem verkürzten progressionsfreien Überleben, Gesamtüberleben und der klinischen Platinresistenz korrelierten. Durch Hinzunahme von ERCC1 als weiterem Marker auf zirkulierenden Tumorzellen konnte die Detektionsrate um etwa 15% erhöht werden. Somit scheinen Tumorzellen mit Stammzellcharakter, in Epithelialer-Mesenchymaler-Transition und resistente Populationen im Hinblick auf die schlechte Prognose des Ovarialkarzinoms bedeutend zu sein. Zusätzliche therapeutische Strategien könnten Signalwege der Tumorstammzellen angreifen, wie z.B. den PI3K/AKT Signalweg. Zusätzlich zu Studien über zirkulierende und disseminierte Tumorzellen werden die Analysen von zirkulierender Tumor-DNA sowie microRNAs als ein „einfacheres“ Werkzeug diskutiert, um minimale Residualkrankheiten zu detektieren und die Erkrankung unter der gegebenen Therapie zu überwachen. In dieser Arbeit wurde ein empfindliches und reproduzierbares Verfahren für die Next-Generation-Sequenzierung-basierte Analyse der zirkulierenden microRNA im Plasma von 15 platinsensiblen und 15 platinresistenten Patientinnen etabliert. Dabei wurden 102 potentiell neue miRNAs detektiert, von denen 22 mindestens in der Hälfte der Proben exprimierten. Die zehn am stärksten microRNAs, die sowohl in platinsensiblen und platinresistenten Proben exprimierten, waren: hsa-miR-128-3p, hsa-miR-99a-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-mir-381-3p, hsa-miR-9-3p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-433-3p, hsa-let-7b-5p. Bisher wurden im Vergleich der microRNA-Signatur von platinsensiblen und platinresistenten Patientinnen keine statistischen Unterschiede festgestellt. Im Nebenprojekt der Promotion wurde der Methylierungsstatus von RASSF-1A an Tumorgeweben, im angrenzenden tumorfreien Gewebe und in korrespondierenden Plasmaproben mittels Real-Time Methylierungsspezifischer PCR und der semiquantitativen Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, das der RASSF-1A-Promoter im Plasma sowie im Tumor, aber auch im benachbarten tumorfreien Gewebe methyliert vorliegt, hier jedoch zu einem geringeren Prozentsatz. Die RASSF-1A-Promoter-Methylierung ergab prognostische Informationen in Bezug auf das Gesamtüberleben. Abschließend scheint die Verwendung der sogenannten "Liquid Biopsy", hier Tumorzellen sowie zirkulierende DNA und miRNAs, für die Einschätzung der Prognose und die Überwachung vom Therapieverlauf des Ovarialkarzinoms attraktiv zu sein. In dieser Hinsicht können die Ergebnisse, die für die Zirkulation von DNA und microRNA erhalten wurden, die Ergebnisse für Tumorzellen ergänzen. Allerdings müssen diese Ergebnisse in klinischen Studien validiert werden, bevor sie für personalisierte Behandlungsstrategien verwendet werden können.

Despite advanced treatment options, the recurrence rate in ovarian carcinoma is approximately 75%. One of the major problems is the resistance to platinum-based chemotherapy in about 15-20% of cases which can only be recognized retrospectively. Thus, a very bad prognosis is attributed to ovarian cancer and it is, therefore, of great interest to develop innovative, blood-based biomarker concepts, which can provide information about prognosis and response during the course of therapy. In this thesis, circulating tumor cells in blood samples and disseminated tumor cells in bone marrow as well as circulating DNA and microRNAs were evaluated as potential biomarkers in primary ovarian cancer patients before surgery and after platinum-based chemotherapy. Establishing a fourfold immunofluorescence staining method for the detection of LIN-28pos and/or SOX-2pos tumor cells with stem cell character in the bone marrow, the presence of these cells could be demonstrated before and after chemotherapy. Both, epithelial and non-epithelial tumor stem cells were detected suggesting that some of these cells were in Epithelial-Mesenchymal-Transition, while epithelial tumor cells with stem cell characteristics did not undergo any transformation or lost their mesenchymal character. The mesenchymal phenotype was also confirmed by studies on circulating tumor cells, representing the most frequently found phenotype which increased up to 20% under therapy. Interestingly, a PI3K/Twistpos phenotype developed under therapy that was not identified before therapy. In addition to mesenchymal and stem cell characteristics of the circulating tumor cells, the presence and persistence of more resistant, ERCC1pos circulating tumor cells could also be demonstrated. The presence of these cells correlated with a shortened progression-free survival, overall survival and clinical platinum resistance. By including ERCC1 as an additional marker on circulating tumor cells, the detection rate could be increased up to 15% before and after therapy. Thus, tumor cells with stem cell characteristics in Epithelial-Mesenchymal-Transition and resistant populations seem to play a role with regard to poor outcome of our ovarian cancer patients. Additional therapeutic strategies could target signalling pathways of the tumor stem cells, e.g. the PI3K/AKT signalling pathway. In addition to studies on circulating and disseminated tumor cells, the analyses of circulating tumor DNA as well as microRNAs is discussed to be a more convenient tool to detect minimal residual disease and monitor disease under the given therapy. In this thesis, a sensitive and reproducible method for the Next-Generation-Sequencing-based analysis of circulating microRNA in human plasma comparing 15 platinum-sensitive and 15 platinum-resistant cases was established. In this case, 102 potentially new miRNAs were detected, of which at least 22 expressed in the half of the samples. The ten most microRNAs expressing both platinum-sensitive and platinum-resistant samples were: hsa-miR-128-3p, hsa-miR-99a-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-9-3p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-433-3p, hsa-let-7b-5p. Up to now, comparing the microRNA signature of platinum-sensitive and platinum-resistant patients, no statistical differences were detected. In a sub project of this thesis, the methylation status of RASSF-1A in tumors, neighbouring tumor-free tissue and in corresponding plasma samples using real-time methylation-specific PCR and the semi-quantitative methylation-sensitive high-resolution melting analysis were investigated. Briefly, RASSF-1A promoter was observed in ctDNA and found highly methylated in primary tumors, and at lower percentages in the adjacent morphologically tumor cell-free tissues. We reported for the first time that RASSF-1A promoter methylation provided significant prognostic information in high grade serous ovarian cancer patients. In conclusion, using the so-called "liquid biopsy", including tumor cells as well as circulating DNA and miRNAs, seem to be attractive for estimating prognosis and monitoring ovarian cancer. In this regard, results obtained for circulating DNA and microRNAs might complement results obtained for tumor cells. However, these results have to be validated in clinical trials before using them for personalized treatment strategies.

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Chebouti, Issam: Evaluierung Blut- und Gewebebasierter Biomarker beim Ovarialkarzinom. 2017.

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