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Role of radiation-induced immune changes for normal tissue toxicity with a focus on CD73/adenosine signaling and macrophages

de Leve, Simone

Radiotherapy (RT) is besides surgery and chemotherapy one standard treatment option for patients suffering from neoplasms in the thoracic room, e.g. lung cancer, breast cancer or head and neck cancer. Due to high normal tissue toxicity of the lung pneumonitis and lung fibrosis are dose-limiting side effects of any RT within the thoracic room, thereby increasing the risk of local relapses and loss of tumor control. Up to now no curative therapies are available to prevent or treat those life-threatening diseases, thus there is a high need to investigate mechanisms that reduce normal tissue toxicity after irradiation. It has been reported that the infiltration of various immune cells is a common feature of radiation-induced pneumonitis and fibrosis. For other fibrotic diseases of the lung e.g. idiopathic pulmonary fibrosis a contribution of CD73 and adenosine on disease progression was reported. Therefore, the present project aimed to give new insights into the contribution of different immune cells to radiation-induced pneumopathy and a potential impact of CD73 and adenosine on disease progression. To study radiation-induced pneumopathy a murine model was used. C57BL/6 wildtype and CD73 knockout (CD73-/-) mice were irradiated with a single high dose of 15 Gy over their whole thorax to study radiation-induced pneumonitis and fibrosis. Thorax irradiation of C57BL/6 mice altered the composition of T cell populations locally and systemically (cervical lymph nodes and spleen). In the lung irradiation led at 3 weeks to increased levels of regulatory T cells (Treg). At six and twelve weeks upon irradiation (pneumonitic phase) an influx of CD3+ T cells was observed. In addition to an increased CD73 expression on T cells, CD73 expression and activity was also upregulated on other immune cells and non-leukocytes in the irradiated lung. Moreover, elevated levels of Treg were found during the fibrotic phase. The upregulation of CD73 was paralleled by progressively accumulating levels of extracellular adenosine. CD73 deficient mice failed to accumulate adenosine in the bronchoalveolar lavage fluid and exhibited significantly less radiation-induced lung fibrosis. Furthermore, treatment of wild-type mice with pegylated adenosine deaminase (PEG-ADA) or CD73 antibodies also significantly reduced radiation-induced lung fibrosis. The development of radiation-induced pulmonary fibrosis in WT mice was accompanied by the accumulation of macrophages within organized clusters expressing pro-fibrotic marker proteins. Interestingly, in CD73-/- mice no organized macrophage clusters and no upregulation of anti-inflammatory markers on macrophages was observed during the fibrotic phase. Furthermore, CD73-/- mice showed a differential expression of members of the hyaluronic system. Taken together the data reveal important roles in disease development for Treg during the early and late phases upon RT as well as for macrophages that accumulate in organized clusters and express anti-inflammatory markers during the fibrotic phase. Importantly the loss of CD73 was associated with reduced levels of adenosine, reduced fibrosis development and accumulation of anti-inflammatory macrophages in organized clusters. While targeting CD73/adenosine provides new treatment possibilities to reduce radiation-induced lung toxicity, the extent of macrophage impact still needs further investigations.

Strahlentherapie ist neben chirurgischen Eingriffen und Chemotherapie eine der Standardbehandlungsmethoden für Patienten, die an Krebserkrankungen im Brustbereich leiden. Dazu gehören beispielsweise Lungen-, Brust- und Kopf-Hals-Krebs. Aufgrund hoher Normalgewebstoxizität der Lungen stellen sich Pneumonitis und Lungenfibrose als dosislimitierende Nebenwirkungen der Strahlentherapie im Brustbereich dar. Dadurch erhöht sich das Risiko von lokalen Rezidiven und dem Verlust der Tumorkontrolle. Da es bisher keine kurativen Therapien zur Vorbeugung oder Behandlung dieser lebensbedrohlichen Folgeerkrankungen gibt, besteht ein großes Interesse an der Erforschung von Mechanismen, die die Normalgewebstoxizität durch Bestrahlung reduzieren können. Es ist bekannt, dass strahleninduzierte Pneumonitis und Fibrose mit der Einwanderung von verschiedenen Immunzellen einhergehen. In anderen fibrotischen Erkrankungen der Lunge wie z.B. der idiopatischen Lungenfibrose wurde eine Beteiligung von CD73 und Adenosin in der Krankheitsentwicklung nachgewiesen. Deshalb setzte sich das vorliegende Projekt zum Ziel neue Einblicke in die Beteiligung verschiedener Immunzellen zur Entstehung strahleninduzierter Lungenerkrankungen zu liefern, sowie den möglichen Einfluss von CD73 und Adenosin auf den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Zur Untersuchung strahleninduzierter Lungenerkrankungen wurde ein murines Model verwendet. C57BL/6 Wildtyp und CD73 Knockout (CD73-/-) Mäuse wurden dazu mit einer einmaligen hohen Bestrahlungsdosis von 15 Gy über ihrem gesamten Thorax bestrahlt, um anschließend strahleninduzierte Pneumonitis und Fibrose untersuchen zu können. Die Thoraxbestrahlung von C57BL/6 Mäusen veränderte die Zusammensetzung der T-Zellpopulationen sowohl lokal als auch systemisch (zervikale Lymphknoten und Milz). In der Lunge führte die Bestrahlung zu einer Erhöhung der Anteile an regulatorischen T-Zellen (Treg) 3 Wochen nach Bestrahlung. Ein Einstrom von CD3+ T-Zellen wurde sechs und zwölf Wochen nach der Strahlenbehandlung (pneumonitische Phase) beobachtet. Die Expression und Aktivität von CD73 in bestrahlten Lungen, war nicht nur auf T-Zellen zu beobachten, sondern auch auf weiteren Immunzellen und Zellen, die nicht zu den Leukozyten gehören, erhöht. Darüber hinaus wurden erhöhte Anteile von Treg auch in der fibrotischen Phase nachgewiesen. Die Hochregulierung von CD73 ging einher mit einer zunehmenden Akkumulation von extrazellulärem Adenosin. In bestrahlten CD73-/- Mäusen hingegen war kein erhöhtes Adenosin sichtbar, welches anhand einer Lungenwaschung (BALF) gemessen wurde.Zudem entwickelten die Tiere eine signifikant verminderte strahleninduzierte Fibrose. Darüber hinaus konnte die Behandlung von Wildtyp Mäusen mit pegylierter Adenosindeaminase (PEG-ADA) oder einem CD73 Antikörper ebenso zu einer signifikant verminderten Lungenfibrose führen. Die Entwicklung einer strahleninduzierten Lungenfibrose ging einher mit der Akkumulation von Makrophagen in organisierten Verbänden, sowie der Expression von pro-fibrotischen Markerproteinen. Interessanterweise wurden in CD73-/- Mäusen keine organisierten Verbände von Makrophagen gefunden. Ferner wurde keine Hochregulierung von anti-inflammatorischen Markerproteinen beobachtet. Darüber hinaus zeigten CD73-/- Mäuse eine veränderte Expression von Proteinen des Hyaluronsäure-System. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse auf entscheidende Beiträge zur Krankheitsentstehung von Treg, während der frühen und späten Phase nach Strahlentherapie, und für Makrophagen, die sich in in der fibrotischen Phase in organisierten Verbänden akkumulieren und anti-inflammatorische Marker exprimieren, hin. Der Verlust von CD73 führte zu verminderten Adenosin Leveln, verminderter Fibroseentwicklung und Akkumulation von anti-inflammatorischen Makrophagen in organisierten Verbänden. Durch gezieltes Behandeln von CD73/Adenosin ergeben sich neue Behandlungsmöglichkeiten zur Reduzierung strahleninduzierter Normalgewebstoxizität. Das Ausmaß des Beitrags von Makrophagen zur strahleninduzierten Lungenfibrose bedarf allerdings weiterer Untersuchungen.

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de Leve, Simone: Role of radiation-induced immune changes for normal tissue toxicity with a focus on CD73/adenosine signaling and macrophages. 2017.

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