Integrated Multi-Sensor System for Parallel In-Situ Monitoring of Biotechnological Processes
Due to increasing complexity of bioprocesses in production and research, e.g. in the fabrication of antibodies and vaccines, and high efficiency and product safety requirements, precise monitoring and control in biotechnology becomes increasingly important. In this work a multi-sensor system for the parallel in-situ monitoring of the four important process parameters glucose, lactate, cell density and pH in bioprocesses is developed.
The fabrication process of the sensor chip, based on a CMOS process flow, is suitable for integration into standard processes and mass production of the system. Thanks to the continuous, parallel measurement directly inside the bioreactor the system is considerably simpler, smaller, more cost-effective and easier to sterilize than the state-of-the-art measurement approach, which involves a separate sensor for every parameter and sampling and external measurement for glucose and lactate.
The focus of this thesis is on the development of amperometric enzyme sensors for glucose and lactate that cover the wide concentration ranges found in bioprocesses. These range from a few millimoles per liter (mM) to concentrations above 1000 mM. To achieve such wide measurement ranges diffusion-limiting membranes
are employed. Two membrane materials, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) and polyurethane (PU), are assessed for this purpose, examining the surface morphology, permeability and long-term performance of fabricated membranes. Using PDMS membranes glucose is measured up to 200 mM, and with sensors covered with PU membranes concentrations up to 600 mM glucose and 900 mM lactate are measured. These ranges include a significant part of the concentrations found in bioprocesses. The glucose sensors are employed in long-term measurements and show good performance in the continuous monitoring of a yeast culture over 13 days and weekly calibration measurements over 30 days.
The cell density sensor is realized as interdigitated platinum electrodes, and cell density is determined via conductivity changes of a cell suspension. Measurements are performed up to 20 g/l dry cell weight, covering a significant part of the cell densities found in bioprocesses.
The pH is determined in C-V measurements via threshold voltage shifts at an electrolyte-insulator-semiconductor structure. Ta2O5 is employed as a pH-sensitive material, deposited on the chip surface by an atomic layer deposition (ALD) process. The sensor is able to measure pH in a range from pH 3 to pH 12, being suitable for any medium used in cell cultures. Both sensors show good performance and tight correlation with reference measurements when used in the monitoring of yeast culture.
The glucose and cell density sensor in parallel are successfully employed in the monitoring of a yeast culture, showing good correlation with reference measurements. The feasibility of the parallel operation of multiple sensors on one chip is proven, and the advantage of the multi-sensor system in comparison to single sensors is demonstrated.
Die wachsende Komplexität heutiger biotechnologischer Prozesse, z.B. in der Herstellung von Antikörpern und Impfstoffen, und immer höhere Anforderungen an die Effizienz der Prozesse und Sicherheit der Produkte erfordern eine präzise Überwachung und Steuerung. In dieser Arbeit wird ein miniaturisiertes Multi- Sensor-System zur parallelen Überwachung vier wichtiger Prozessgrößen entwickelt: Glukose und Laktat in weiten Konzentrationsbereichen, pH und Zelldichte.
Das auf einem Silizium-Chip integrierte System wird in einem CMOS-basierten, für die Massenproduktion geeigneten Fertigungsverfahren hergestellt und hat eine Größe von nur 7,16 mm 7,16 mm, wodurch es auch in kleinen Bioreaktoren wie Zellkulturflaschen eingesetzt werden kann. Hierdurch und durch die kontinuierliche, parallele Messung direkt im Bioreaktor ist das System gegenüber dem bisher üblichen Messaufbau, der einen separaten Sensor für jeden Parameter und Probennahme und externe Messungen für Glukose und Laktat vorsieht, deutlich im Vorteil. Es ist kleiner, kostengünstiger, einfacher zu handhaben und leichter zu sterilisieren. Weiterhin ermöglicht die räumliche Nähe der Sensoren die gegenseitige Korrektur der Messwerte und das Erkennen von Drifts und anderen Abweichungen.
Das Hauptaugenmerk der Arbeit liegt auf der Entwicklung von amperometrischen Enzymsensoren für Glukose und Laktat, die an die in Bioprozessen üblichen weiten Konzentrationsbereiche von wenigen Millimol pro Liter (mM) bis über 1000 mM angepasst sind. Um in solch weiten Bereichen messen zu können, werden diffusionsbegrenzende Membranen verwendet, die den Stoffstrom zur Enzymschicht auf dem Sensor verringern. Es werden zwei Membranmaterialien, Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und Polyurethan (PU), auf ihre Eignung für diese Anwendung hin untersucht, wobei Untersuchungen zu Oberflächenbeschaffenheit, Durchlässigkeit und Langzeitstabilität der Membranen durchgeführt werden. Mit Hilfe der PDMS-Membranen können Glukosekonzentrationen bis 200 mM gemessen werden, mit den PU-Membranen Konzentrationen bis 600 mM Glukose und 900 mM Laktat. Diese Messbereiche decken einen Großteil der in Bioprozessen vorkommenden Konzentrationen ab. Die Glukosesensoren werden in Langzeitversuchen eingesetzt und zeigen eine Einsatzdauer von 13 Tagen bei der kontinuierlichen Glukosemessung in einer Hefekultur und 30 Tagen bei wöchentlichen Kalibriermessungen.
Der Zelldichtesensor ist in Form von Fingerelektroden aus Platin ausgeführt und bestimmt die Zelldichte über die Messung der Leitfähigkeit einer Zelllösung. Es werden Messungen bis 20 g/l Trockenzellmasse in Hefekulturen gezeigt, was einen weiten Bereich der in Bioprozessen vorkommenden Zelldichten abdeckt.
Der pH-Wert wird in C-U-Messungen am Chip über die Veränderung der Schwellenspannung bestimmt. Als pH-empfindliches Material wird Ta2O5 verwendet, das mittels Atomlagenabscheidung (ALD) auf dem Multi-Sensor-Chip abgeschieden wird. Es wird ein Messbereich von pH 3 bis pH 12 erreicht, der das gesamte pH-Spektrum der in Bioprozessen genutzten Kulturlösungen umfasst.
Beide Sensoren werden in der kontinuierlichen Überwachung von Hefekulturen eingesetzt und liefern Messwerte in guter Übereinstimmung mit Referenzmessungen.
Durch die parallele Überwachung von Glukosekonzentration und Zelldichte in einer Hefekultur werden der gleichzeitige Betrieb mehrerer Sensoren auf einem Chip demonstriert und die Vorteile des Multi-Sensor-Systems gegenüber dem Einsatz einzelner Sensoren gezeigt.
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