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Characterization of the murine pulmonary phagocytic network during Aspergillus fumigatus infection

Seddigh, Pegah

Aspergillus fumigatus is a ubiquitous, airborne mold and a common threat for immunosuppressed patients as it can induce invasive aspergillosis, characterized by a tremendously high mortality rate. Immunocompetent individuals on the other hand, encounter this infection very efficiently due to the phagocytic action of different immune cell types such as alveolar macrophages, neutrophil granulocytes and dendritic cells we believe, that beside these professional phagocytes, “unprofessional” phagocytic cells, such as alveolar epithelial type I and II cells (AEC) also constitute a central element for encountering fungal invasion. Although many studies have deeply analyzed the interaction between professional phagocytes and A. fumigatus, just few works have concentrated on the fungal interaction with alveolar epithelial cells. With this ground, we started with analyzing the proteome regulation of AECII after pulmonary A. fumigatus infection. We started with the successful establishment of a negative, magnetic isolation protocol to isolate primary murine AECII with purity greater than 90 %. Using this method, we isolated AECII from infected murine lungs and characterized their proteomic constitution by liquid chromatography mass spectrometry (LCMS) in comparison to AECII from uninfected animals. From the resulting list of significantly regulated proteins the protein with the highest up-regulation was chosen for further investigation in the context of an A. fumigatus infection. By additional experimental approaches, such as qRT-PCR, Western Blot and Immunohistology we could first of all confirm the initially detected high level of up-regulation. Subsequently, we employed a knock-out mouse model for the protein to investigate its significance under infection conditions. Addressing different parameters, such as survival, colony forming units (CFU), Neutrophil recruitment to the lungs of the infected animals and TNF- α secretion level in bronchoalveolar lavage fluid, we unfortunately could not find a different behavior of this mouse strain, compared to wildtype animals. Hence, future work should characterize the role and importance of further promising proteins from the generated list of this work. The next cell type to investigate in this study was neutrophil granulocytes as they are known to be the major immune cells in number and function for facing A. fumigatus infection inside the lung. Additionally, neutropenia is the main cause of death for IA patients. The aim for this part of the study was to isolate neutrophil granulocytes from different sites of the same mouse. In other words, protocols for neutrophil isolation of bone marrow, blood and bronchoalveolar lavage (BAL) of A. fumigatus infected animals had to be set up. The novel “Catchup” mouse line with transgenic tdTomato expressing neutrophils was the useful tool to perform this task. After neutrophil isolation, they were further investigated in protein level by LCMS. Over 3000 proteins were detected and analyzed in a principal component plot. According to this data the neutrophil group isolated from BAL with direct contact to fungal spores indicated the most variance in protein abundancies. With this hint further investigation on the expressed proteins from this experimental group should be performed such as looking for phenotypes in the knock out mice for the most relevant regulated proteins during A. fumigatus infection.

Aspergillus fumigatus ist ein ubiquitärer, luftübertragener Schimmelpilz, der eine weit verbreitete Gefahr für immunsupprimierte Patienten darstellt und in der Lage ist, die invasive Aspergillose (IA) hervorzurufen, ein Krankheitsbild mit hoher Sterblichkeitsrate. In immunkompetenten Individuen hingegen wird diese Infektion sehr effizient mit Hilfe der phagozytotischen Eigenschaften verschiedener Zelltypen des Immunsystems, wie beispielsweise Alveolarmakrophagen, Neutrophile Granulozyten und Dendritische Zellen, bekämpft. Möglicherweise spielen jedoch neben den drei oben genannten professionellen Phagozyten, auch „unprofessionelle“ phagozytotische Zellen, wie die alveolaren Epithelzellen des Typs I und II (AEC) eine zentrale Rolle für die Bewältigung der Pilzinvasion. Obwohl bereits viele Studien die Interaktion zwischen professionellen Phagozyten und A. fumigatus detailliert analysiert haben, konzentrieren sich nur wenige Arbeiten auf die Interaktion des Pilzes mit alveolaren Epithelzellen. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit mit der Analyse der Proteomregulation der AECII nach pulmonaler A.fumigatus Infektion begonnen. Zuerst wurde ein Protokoll zur negativen, magnetischen Isolierung muriner AECII mit einer Reinheit von über 90% erfolgreich etabliert. Mit Hilfe dieser Methode wurden dann AECII aus infizierten Mauslungen isoliert und ihr Proteom im Vergleich zu AECII aus nicht infizierten Tieren mittels Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LCMS) analysiert. Aus der sich ergebenden Liste signifikant regulierter Proteine wurde das Protein mit der deutlichsten Hochregulierung für weitere Untersuchungen im Rahmen von A.fumigatus Infektionen ausgewählt. Durch weitere experimentelle Ansätze, wie qRT-PCR, Western Blot und Immunhistochemie konnte zunächst die deutliche Hochregulierung des Proteins bestätigt werden. Anschließend wurde ein Mausmodel mit knock-out für das entsprechende Protein verwendet, um seine Bedeutung unter Infektionsbedingungen zu untersuchen. Aus Parametern wie Überlebensrate, Kolonie bildenden Einheiten (CFUs), Neutrophilenrekrutierung in die Lunge infizierter Tiere und TNF-α-Sekretions-Level in Proben aus der bronchoalveolaren Lavage, konnten keine Unterschiede in dieser Mauslinie im Vergleich zu Wildtypmäusen festgestellt werden. Die Rolle und Bedeutung weiterer vielversprechenden Proteine aus der in dieser Arbeit erstellten Liste sollten daher in künftigen Arbeiten charakterisiert werden Einen weiteren zu untersuchenden Zelltyp in dieser Studie stellten die Neutrophilen Granulozyten dar, da sie in Bezug auf Anzahl und Funktion die wichtigsten Zellen im Verlauf einer A.fumigatus-Infektion der Lunge sind. Darüber hinaus ist Neutropenie die häufigste Todesursache bei Patienten mit invasiver Aspergillose . Das Ziel in diesem Teil der Studie war es, die Neutrophilen Granulozyten aus verschiedenen Stellen der Maus zu isolieren. Zu diesem Zweck mussten Protokolle etabliert werden für die Isolierung von Neutrophilen aus dem Knochenmark, Blut und bronchoalveolarer Lavage (BAL) von A. fumigatus infizierten Tieren . Die neue „Catchup“ Mauslinie mit transgenen tdTomato exprimierenden Neutrophilen stellte hierfür das perfekte Werkzeug dar. Nach der Isolierung von Neutrophilen wurde ihre Proteinzusammensetzung mittels LCMS charakterisiert. Über 3000 Proteine wurden detektiert und mittels Hauptkomponentenanalyse untersucht. Diese Daten zeigten, dass die Neutrophilengruppe aus der BAL-Isolation mit unmittelbarem Kontakt zu Pilzsporen die deutlichsten Änderungen bezogen auf die Proteinmenge aufweist. Diesem Ergebnis folgend sollten sich künftige Untersuchungen, wie z.B. die Charakterisierung von Phänotypen in entsprechenden knock out Mäusen, auf Proteine konzentrieren, die in dieser experimentellen Gruppe deutlich reguliert waren.

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Seddigh, Pegah: Characterization of the murine pulmonary phagocytic network during Aspergillus fumigatus infection. 2017.

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