Chemische Modulation der medizinisch relevanten HtrA Proteasen DegS und HTRA1
Innerhalb der wichtigen Gruppe der Serinproteasen spielen die sog. HtrA-Proteasen (high temperature requierement A) in vielen medizinisch relevanten Prozessen wichtige Rollen. Im Zusammenhang mit dieser Arbeit besonders hervorzuheben ist die humane HtrA-Protease HTRA1 und das bakterielle DegS. DegS ist an einer sehr spezifischen Stressantwort auf ungefaltete Proteine im extracytoplasmatischen Raum von Bakterien maßgeblich beteiligt. In Stresssituationen liegen Außenmembranproteine in ungefalteter Form vor, das erkennt DegS über eine Motiv-spezifische Bindung und wird dadurch aktiviert, es kann dann den Antisigmafaktor RseA an einer spezifischen Stelle schneiden, sodass dieser weiter prozessiert werden kann. Durch diese Prozessierung wird der Sigmafaktor σE freigesetzt und initiiert die Stressantwort, wozu die höhere Expression von Faltungshelfern und Proteasen gehören um die vorhandene Last abzubauen, und ebenso die Verringerung der Expression von Außenmembranproteinen und der Proteinherstellung im Allgemeinen. Aufgrund dieser Schlüsselrolle in der Stressantwort ist DegS ein essentielles Protein für E. coli und viele andere Gram-negative Bakterien. Aber selbst in vielen Gram-positiven Bakterien ist DegS unerlässlich für Virulenz. Die gezielte Suche nach einem Inhibitor und die Weiterentwicklung dieses Moleküls unter medizinal-chemischen Gesichtspunkten kann zu einem potenten Antibiotikum führen. Dieses wäre im Hinblick auf die heutige Knappheit an neuen Antibiotika und der fortschreitenden Entwicklung von Resistenzen ein wertvoller Fortschritt in der medizinischen Bekämpfung von Infektionskrankheiten. So wurde bereits im Vorfeld ein Screening durchgeführt um potentielle Inhibitoren von DegS aus einer Substanzbibliothek von etwa 185 000 Molekülen zu finden. Diese Moleküle wurden dann in verschiedenen Assays weiter untersucht und charakterisiert, diese Suche führte einem spezifischen, dosis-abhängigen und potentem Inhibitor von DegS in-vivo und in-vitro, LDC043908. Die Charakterisierung des Wirkmechanismus über Mutantenanalysen deutet auf eine Inhibition der allosterischen Aktivierung von DegS hin. Dabei muss nach den bisherigen Erkenntnissen aus Bindungs- und Aktivierungsstudien die Bindung des Inhibitors an die Aktivatorpeptidbindestelle angenommen werden. Derivatisierung führte zu einer noch spezifischeren und potenteren Inhibition von DegS in-vitro und auch in-vivo. HTRA1 erfüllt diverse Aufgaben und ist an der Prozessierung verschiedener Substrate beteiligt. Durch seine diversen Aufgaben ist bei Fehlfunktion mit verschiedensten Krankheiten verknüpft. So ist es etwa bei Unterfunktion (bzw. -expression) in die 1. Zusammenfassung 14 Entstehung verschiedener Krebsarten involviert, sowie erhöhter Migration und vermindertem Ansprechen auf Chemotherapeutika. Eine Überfunktion (bzw. -expression) kann zu erhöhter Zellproliferation und Tumorwachstum führen, genau so ist dieser Befund oft mit Entzündungsprozessen wie in Arthritis und altersbedingter Makuladegeneration (AMD) verknüpft. Ebenfalls über ein wie oben beschriebenes Screening und weiterführende orthogonale Untersuchungen sollten Inhibitoren von HTRA1 identifiziert werden. Dabei konnten 7 verschiedene Moleküle gefunden werden, die innerhalb von sechs Gruppen mit jeweils verschiedenen Derivaten charakterisiert wurden. Es konnten grundlegende Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Spezifitätsmuster (mit anderen Serinproteasen: HTRA2/3/4, DegS, DegP, Trypsin, Chymotrypsin und Elastase) herausgearbeitet werden. Der Wirkmechanismus der größten Gruppe über Massenspektrometrie eindeutig als active-site Inhibition mit kovalenter Bindung an das katalytisch aktive Serin bestimmt. Aufgrund von Problemen mit der Stabilität in wässrigen Lösungen und weiterer Derivatisierung ist dieser Teilaspekt noch unter weiterer Bearbeitung. Neben den Inhibitoren der beiden Proteasen konnte auch eine Gruppe von Molekülen gefunden werden, die eine starke, aktivierungsabhängige Steigerung der katalytischen Aktivität von DegS bewirkt. Parallel dazu haben diese Moleküle auch einen starken Einfluss auf HTRA1. Während die meisten Moleküle dieser Gruppe die Stabilität von HTRA1 negativ beeinflussen und so ein Substrat vor dem katalytischen Verdau schützen können, erreicht ein Molekül das auch ohne Destabilisierung der Protease. Die chemische Reaktion der Moleküle in Wasser und mit den Proteinen DegS und HTRA1 konnte durch Massenspektrometrie eindeutig gezeigt werden, unklar bleibt dabei aber vor Allem der Wirkmechanismus für HTRA1. Während hier einige Modifikationen festzustellen sind, bleibt zu klären wie diese Modifikationen Stabilität und Aktivität von HTRA1 beeinflussen können. Im Falle von DegS wird mit hoher Wahrscheinlichkeit eine inhibitorische Interaktion unterbrochen und so die Aktivität gesteigert. Weitere Untersuchungen der unterliegenden Mechanismen sollen Erkenntnisse über regulatorische Prozesse der Proteasen liefern und dabei helfen diese Gruppe von Molekülen zu spezifischen Aktivatoren und/oder Inhibitoren von DegS und HTRA1 weiterzuentwickeln.
Within the important group of Serine-proteases, HtrA (high temperature requirement A) proteases play important roles in several medically important scenarios. In connection to this work, the roles of human HTRA1 and bacterial DegS protease should be emphasized. DegS is very important for a specific stress response for unfolded proteins in the extracytoplasmic space of bacteria. If folding stress is indicated, unfolded outer membrane proteins (OMPs) will be available for binding to DegS via specific motifs which are usually not present in correctly folded proteins. This binding process initiates activation of DegS which can now cleave one specific bond in anti-sigma factor RseA which in turn is enabled for further processing. This leads to free σE and the stress reaction. The reaction consists of downregulated expression of OMPs, upregulated expression of folding catalysts and proteases, and many other regulations. Based on this key role in stress response, DegS is considered an essential protein in E. coli and many other gram negatives, but further more it is very important for virulence even in many gram positives. Directing screening for an inhibitor of DegS and further development of the compound(s) under medicinal chemical aspects can lead to a potent antibiotic. With regard to todays shortage of new antibiotics and further developing resistances in bacteria this would represent an important progress in fighting infectious diseases. To this end, a compound library of about 185.000 different small molecules was screened in advance of this work. Detected molecules were further analyzed and characterized to reveal one compound, LDC043908, that was a potent, doses dependent, and specific inhibitor of DegS in vitro and in vivo. Further investigation by analysis of several DegS mutants hints at a mechanism of action by inhibiting allosteric activation of DegS. It is very likely that LDC043908 binds to the same motif specific activating peptides would also bind to, which was determined by binding and activation studies in-vitro. Derivatization and further investigation lead to more specific and even more potent inhibitors of DegS. HTRA1 performs several tasks and is involved in the processing of many different substrates. From this diversity, malfunction of HTRA1 is easily connected to many kinds of diseases. Downregulated function or expression is involved in emergence of several cancers, as wells as elevated migration of cancer cells ands decreased susceptibility to chemotherapeutic substances. Upregulated function or expression of HTRA1 can lead to elevated proliferation of cells and tumor growth, furthermore is is found in several inflammation processes like arthritis and age-related macular degeneration. Likewise, to the DegS screening, one was performed for HTRA1 inhibitors and further assays were carried out. Seven molecules could be found thereby and further characterization within six groups with many derivatives took place. Essential relationships 1. Zusammenfassung 16 for structure, activity and specificity (within HTRA2/3/3, DegS, DegP, Trypsin, Chymotrypsin, and Elastase) were established for all groups of inhibitors. The mechanism of action for the biggest group was determined by mass spectrometry and localized to covalent binding of inhibitors to the active-site serine. Due to stability issues of the compounds in aqueous solvents and further derivatization this sub-project is on going with our partner LDC in Dortmund. In parallel to finding and developing inhibitors for both proteases, one group of molecules was found that had very different influence on DegS and HTRA1. While compounds of this class elevated the activator-peptide dependent activity of DegS, they negatively influenced stability of HTRA1 and thereby inhibited substrate digestion by the protease. On compound inhibited HTRA1 from processing its substrate without destabilizing the protease. Chemical reactions of the molecules with water and with DegS and HTRA1 could be determined by mass spectrometry, whereas the exact mechanism of action remains unclear for HTRA1. While several modifications of HTRA1 can be found it is still to be elucidated which of them important and how they influence activity and stability of HTRA1. In case of DegS it is very likely that compounds destroy an inhibitory interaction between two distinct domains of the protease and thereby elevated catalytic activity of DegS. Further investigations of underlying mechanisms shall shad light on some more regulatory processes within the proteases and help developing specific activators and/or inhibitors of both DegS and HTRA1 from these compounds as starting points.
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