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Räumliche Visualisierung und Kolokalisation von Proteinen in ceramidreichen Domänen

Imhäuser, Christian

Das Clustering von Rezeptor- und Signal-Molekülen (wie CD95 oder CD40) innerhalb ceramidreicher Membran-Domänen führt zu sehr hohen Dichten dieser Proteine. Hierdurch werden die Aktivierung entsprechender Enzyme, der Ausschluss hemmender Moleküle und/oder die Gewinnung weiterer Signal-Moleküle erleichtert, um das entsprechende Signal des Rezeptors in die Zellen zu übertragen. Bis heute sind die Mechanismen des Rezeptor-Clusterings nicht entschlüsselt und die genaue Verteilung von Proteinen innerhalb ceramidreicher Domänen unbekannt. Daher wurden unter Zuhilfenahme eines Laser-Scanning-Mikroskops Schichtbilder aus Zellproben von JY-Zellen erzeugt, die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-gekoppelten anti-Ceramid- und Cy3-markierten anti-CD95-Antikörpern gefärbt waren. Aus dem Bildmaterial konnten nach der Bildvorverarbeitung mittels geeigneter Filter zur Kontrastverbesserung und Rauschunterdrückung räumliche Modelle mit Hilfe angepasster Verfahren des Volumerenderings und der Oberflächenrekonstruktion generiert werden. Die erzeugten interaktiven Visualisierungen unterstützten die räumliche Analyse, und es konnte für den verwendeten Zelltyp (JY-Zellen) eine räumliche Darstellung der Ceramid- und CD95-Verteilungen sowie deren Kolokalisationen erstmals gezeigt werden. Durch erweiterte und eigens entwickelte, evaluierte Methoden (Produktintensität, Binärisierung) sowie die räumliche Anwendung der Kreuzkovarianzfunktion (KKF) konnte die Bestimmung des qualitativen Kolokalisationsgrades vereinfacht werden. Ferner konnten räumliche Fluorogramme erzeugt werden, aus denen ein neuartiges, alternatives Verfahren (Absolut-Delta-Koeffizient) zu den ebenso räumlich angewandten Standardverfahren zur quantitativen Kolokalisationsbestimmung abgeleitet wurde. Die resultierenden Werte der Kolokalisationsanalyse bestätigten das bedeutsame Mitwirken des Ceramids an dem CD95-Clustering. Insgesamt verbesserte die eigens entwickelte Software das Verständnis über den Prozess des CD95-Clusterings, und wurde generisch konzipiert, um für weiterführende Arbeiten eingesetzt werden zu können.

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Zitierform:

Imhäuser, Christian: Räumliche Visualisierung und Kolokalisation von Proteinen in ceramidreichen Domänen. 2016.

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