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Assessment of the impact of deregulated signal transduction pathways on the radiotherapy response of non-small-cell lung cancer

Wieczorek, Sarah Alexandra

Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide. Approximately 85 % of all lung cancers are histologically grouped as non-small-cell lung cancer (NSCLC). Besides surgery and chemotherapy, radiotherapy is firmly established as an important modality in curative treatment of localized as well as locally advanced NSCLC and in palliative care. Nevertheless, systemic and localized relapse is frequently observed. Recent developments have led to a more refined typing of advanced NSCLC by incorporating biomarkers of oncogenic pathway activation. This has allowed the successful introduction of "targeted pharmacotherapies" that are better tailored towards biological differences between histologically uniform NSCLC entities. In contrast, radiotherapy still does not take advantage of biological disease heterogeneity, and radiosensitization protocols are empirically derived, rather than based on validated biomarkers. Against this background, it was hypothesized that an improved understanding of the modulation of the radiotherapy response of NSCLC by signal transduction pathways may open new avenues for the development of more specific protocols to combine radiotherapy with pharmacotherapies. To this end, a systematic assessment of the functional impact of selected regulators of apoptosis, oncogenes, and signal transduction mediators on irradiation-induced cell death was initiated in a small-scale screen of lung cancer models. Anti-apoptotic members of the BCL-2 family have been selected as the first group of potential biomarkers for the radiotherapy response in NSCLC. BCL-xL as well as MCL-1 conferred resistance against irradiation in A431 cells. Expression of both modulators led to decreased radiation-induced cell death and additionally gave a competitive edge in clonogenic survival in vitro. Studies obtained by radiation therapy of tumor-bearing mice in vivo supported the relevance of BCL-xL for radioresistance in an organismal context. Surprisingly, these findings were not convincingly explained by BCL-xL and MCL-1 mediating radioresistance by inhibition of apoptosis, as radiotherapy induced only negligible amounts of apoptosis. Also no impact of BCL-xL on cell cycle kinetics following irradiation was observed. Studying the influence of BCL-xL on deoxyribonucleic acid (DNA) double-strand break (DSB) repair pathways as a potential effector mechanism revealed that BCL-xL-mediated radioresistance relied on functional homologous recombination repair (HRR) and involved enhanced repair through error-prone alternative end-joining (alt-EJ). This led to the propagation of cells with gross chromosomal aberrations, possibly promoting survival of more resistant and aggressive lung cancer subclones. To circumvent this, combining irradiation with targeted therapies against anti-apoptotic BCL-2 family members was suggested as a useful strategy. Thus, BCL-xL and/or MCL-1 were antagonized on a genetic or functional level. These strategies, including shRNA-mediated knockdown, conditional overexpression of pro-apoptotic BAK, as well as pharmacological treatment with BH3-mimetics, sensitized lung cancer cells to radiotherapy. Based on this, it is proposed to select patients with high expression of the respective drug targets in recent tumor biopsies for clinical proof-of-principle studies combining radiotherapy with pharmacologic antagonists of the BCL-2 family such as Navitoclax. The signal transduction mediator RAF-1 was identified as the second potential biomarker for the radiotherapy response in NSCLC. Conditional activation of RAF-1 reduced the number of irradiation-induced cell death significantly. Clonogenic survival could not be evaluated as RAF-1 activation itself inhibited colony formation in general, possibly due to induction of a cell cycle arrest or senescence. It was further shown that activation of RAF-1 even after irradiation had still radioprotective effects. The underlying mechanisms remain to be elucidated in technically more appropriate models, in particular in vivo. In conclusion, two modulators of the radiotherapy response in NSCLC were identified and functionally validated. In addition, targeting non-apoptotic functions of BCL-2 family proteins was nominated as a novel strategy for biologically rational radiosensitization protocols.

Lungenkarzinome sind weltweit die häufigste Ursache für krebs-assoziierte Todesfälle. Histologisch werden verschiedene Subtypen unterschieden, wobei etwa 85 % als nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (non-small cell lung cancer, NSCLC) diagnostiziert werden. Eine gezielte Bestrahlung stellt neben der operativen Entfernung des Tumors sowie der systemischen Behandlung mit Chemotherapeutika eine wichtige Methode zur kurativen Behandlung von lokal-begrenzten sowie fortgeschrittenen Tumoren dar. Darüber hinaus wird auch in der palliativen Behandlung von NSCLC Bestrahlung eingesetzt. Allerdings entwickeln sich häufig nach einiger Zeit lokale oder systemische Rezidive. Neue Forschungsergebnisse ermöglichen inzwischen eine genauere Definition von Subtypen des NSCLC auf Basis von molekularen Biomarkern. Insbesondere die Aktivierung bestimmter Onkogene bzw. onkogener Signalwege spielt hier eine Rolle und führten zur erfolgreichen Etablierung von zielgerichteten Pharmakotherapien. Im Rahmen einer Bestrahlungstherapie werden derzeit molekulare Charakteristika der jeweiligen Tumore nicht systematisch berücksichtigt, obwohl individuelle Unterschiede in Bezug auf Ansprechraten bei Bestrahlungstherapien als Hinweis auf diskrepante molekulare Konstitutionen der Tumore gewertet werden können. Validierte Biomarker für eine Korrelation mit dem Ansprechen auf eine Strahlentherapie sind bisher jedoch nicht bekannt. Daher wurden Kombinationstherapien aus Bestrahlung und sensitivierender Chemotherapie eher empirisch entwickelt. Es wird vermutet, dass ein besseres Verständnis von aberranten Signaltransduktionswegen, die die Strahlentherapieantwort modulieren, zur Entwicklung von spezifischeren, rationalen Behandlungsprotokollen, die Strahlentherapie mit zielgerichteter Pharmakotherapie kombinieren, beitragen kann. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit der Einfluss von ausgewählten Apoptose-Regulatoren, Onkogenen und Mediatoren von Signalwegen auf den Zelltod nach Bestrahlung im Rahmen eines begrenzten „screens“ untersucht. Als eine erste Gruppe von potentiellen Biomarkern für eine Modulation der Strahlentherapieantwort wurden anti-apoptotische Mitglieder der BCL-2 Proteinfamilie identifiziert. Sowohl BCL-xL als auch MCL-1 vermittelten in A431 Zellen Resistenz gegenüber Bestrahlung. Dies zeigte sich zum einen an der Verminderung von strahlen-induziertem Zelltod nach stabiler Überexpression dieser Modulatoren. Zum anderen steigerte die Überexpression auch das klonogene Überleben der jeweiligen Zellen. Der modulierende Einfluss von BCL-xL auf die Strahlenresistenz konnte auch in Xenograft-Modellen in Mäusen nachgewiesen werden. Überraschenderweise war dieser Effekt jedoch nicht präferentiell auf die anti-apoptotische Funktion von BCL-xL und MCL-1 zurückzuführen, da Bestrahlung generell nur zu einer minimalen Steigerung der Apoptose führte. Da auch strahlen-induzierte Zellzyklus-Veränderungen durch BCL-xL kaum beeinflusst wurden, wurde vermutet, dass BCL-xL einen Einfluss auf die Reparatur von Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Schäden haben könnte, die als direkte oder indirekte Folge einer Bestrahlung entstehen. Tatsächlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die BCL-xL-vermittelte Strahlenresistenz von der Funktionalität des Reparaturweges der homologen Rekombination (homologous recombination repair, HRR) abhängig war und die Überexpression von BCL-xL darüber hinaus zu einer gesteigerten Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen durch die alternative Endverknüpfung (alternative end-joining, alt-EJ) führte. Da dieser Reparaturweg sehr fehleranfällig ist, führte dies zu einem verstärkten Auftreten von Zellen mit Chromosomenaberrationen. Dies könnte in der weiteren Folge im Patienten dazu führen, dass Zellpopulationen entstehen, die einen resistenteren und aggressiveren Phänotyp aufweisen. Um dies zu verhindern, sollten Tumore, die eine Überexpression von anti-apoptotischen BCL-2 Familienmitgliedern aufweisen, mit einer Kombination aus Bestrahlung und zielgerichteten Medikamenten behandelt werden. Dass dies erfolgversprechend sein kann, konnte hier durch verschiedene Methoden gezeigt werden, bei denen BCL-xL und/oder MCL-1 genetisch bzw. funktionell antagonisiert wurden. Diese Methoden umfassten shRNA-vermittelte „knockdowns“, konditionale Überexpression des pro-apoptotischen Proteins BAK sowie die pharmakologische Behandlung von Zellen mit sogenannten „BH3-Mimetika“. Alle diese experimentellen Ansätze führten zu einer Sensitivierung von Lungenkrebszellen gegenüber Bestrahlung. In einem nächsten Schritt sollte dieses Konzept folglich auch klinisch im Rahmen von Studien untersucht werden. Dabei könnte eine Bestrahlungstherapie bei Tumoren, die eine erhöhte Expression von anti-apoptotischen BCL-2 Proteinen aufweisen, z.B. mit Navitoclax kombiniert werden. Als zweiter potentieller Biomarker der Strahlentherapieantwort bei NSCLC konnte die Serin/Threonin Kinase RAF-1, ein essentielles Signaltransduktionsmolekül, identifiziert werden. In verschiedenen Experimenten führte die konditionale Aktivierung von RAF-1 zu einer signifikanten Verminderung des strahlen-induzierten Zelltods. Das klonogene Überleben in Abhängigkeit von RAF-1 Aktivierung konnte nicht eruiert werden, da bei dem verwendeten System eine permanent aktivierte RAF-1 Kinase das Koloniewachstum allgemein inhibierte. Ein möglicher Erklärungsansatz könnte sein, dass die Aktivierung von RAF-1 zur Induktion eines G2 Arrests führte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von RAF-1 auch nach Bestrahlung ausreichend ist, um die Zellen vor strahlen-induziertem Zelltod zu schützen. Um die Mechanismen der RAF-1-vermittelten Strahlenresistenz zu ermitteln, sind weitere Studien notwendig. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit also zwei unterschiedliche Modulatoren der Strahlentherapieantwort bei NSCLC identifiziert werden, welche sich potenziell für den Einsatz von Biomarker-gesteuerten Therapieprotokollen im Rahmen von klinischen Studien eignen.

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Wieczorek, Sarah Alexandra: Assessment of the impact of deregulated signal transduction pathways on the radiotherapy response of non-small-cell lung cancer. 2018.

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