DuEPublico 2

Dies ist unser neues Repositorium, derzeit für E-Dissertationen und ausgewählte weitere Publikationen. Weitere Informationen...

Regulation der NKG2D Stressliganden MICA, MICB und ULBP2 in proliferierenden und seneszenten Tumorzellen

Baingo, Jolanthe

Das maligne Melanom stellt die tödlichste Form aller Hautkrebserkrankungen dar und entsteht durch eine maligne Transformation der Melanozyten. Melanomzellen können durch zytotoxische Lymphozyten, wie NK Zellen und T Zellen als entartet erkannt und getötet werden. Beide Lymphozytensubgruppen kennzeichnet die Expression des Rezeptors NGK2D, der Stress-induzierte Liganden der MIC und ULBP Molekülfamilie auf den Tumorzellen detektiert und damit zur Aktivierung der mmuneffektoren beiträgt. Melanomzellen exprimieren die NKG2D Liganden (NKG2DL) MICA, MICB und ULBP2 auf ihrer Oberfläche. Die Rolle onkogener Signalwege in der Regulation der NKG2DL Expression in Melanomzellen ist bislang ungeklärt. Neben einer konstitutiven Aktivierung des MAP-Kinase Signalwegs, gesteuert durch die BRAF Mutante V600E, ist die PI3K-AKT Signalkaskade wichtig für die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Da die Hemmung der PI3K in einer Repression der Proliferation mündet, wird diese Kinase als Wirkstoffziel für die Tumortherapie untersucht. Die Proliferationsblockade kann von transienter oder permanenter Natur sein - letzteres, einhergehend mit der Ausbildung eines seneszenten Phänotyps der Tumorzellen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern PI3K- sowie AKTabhängige Signale die NKG2DL Expression in Melanomzellen beeinflussen und wie sich Seneszenz auf die NKG2DL Expression auswirkt. Dazu wurde zunächst die Aktivität der PI3K in verschiedenen Melanomzelllinien durch den Inhibitor LY294002 gehemmt. Dies führte zu einer verminderten MICA, MICB und ULBP2 Oberflächenexpression, unabhängig von deren BRAF Mutationsstatus. Eine stärkere Herabregulation konnte durch Verwendung des klinisch relevanten Inhibitors GSK2126458 erzielt werden, der in deutlich niedrigerer Konzentration zu einer Blockade der PI3K Signalgebung führte, gemessen anhand der Phosphorylierung der PI3K-kontrollierten Kinase AKT sowie stromabwärts gelegener Zielstrukturen des Signalweges. Die PI3K Blockade verursachte neben einer verminderten Oberflächenexpression eine deutliche Reduktion des NKG2DL Gesamtproteins und der spezifischen mRNA, was bereits vier Stunden nach Inhibitorbehandlung detektierbar war. Die Herabregulation der NKG2DL Oberflächenexpression durch den Inhibitor GSK2126458 resultierte in einer verringerten NKG2D-abhängigen NK Zellerkennung der Melanomzellen. Da bekannt ist, dass eine Blockade der PI3K Signalgebung indirekt mit einer Aktivierung des Tumorsuppressors p53 einhergeht, wurde die Rolle von p53 unter Verwendung der syngenen Kolonkarzinomzelllinien HCT116p53+/+ und HCT116p53-/- überprüft. In beiden Zelllinien führte die PI3K Inhibition zu einer Reduktion der MICA, MICB und ULBP2 Expression, wenngleich diese in den HCT116p53+/+ Zellen stärker ausfiel. In jedem Fall konnte eine NKG2DL Herabregulation auf der Ebene des Oberflächen- und Gesamt-Proteins sowie der mRNA beobachtet werden. Um zu prüfen, inwieweit AKT in der Regulation der NKG2DL Expression involviert ist, wurden Melanomzellen mit dem AKT Inhibitor GSK2110183 behandelt. Die Inhibitorexposition verursachte eine schwächere ULBP2 Expression auf der Oberfläche, auf Gesamtprotein- sowie mRNA-Ebene, während die Effekte auf die MICA und MICB Expression nicht konsistent ausfielen. Eine Herabregulation von ULBP2 konnte unter AKT Inhibition auch in HCT116p53+/+ und HCT116p53-/- Zellen beobachtet werden. Dementsprechend führte die transiente Transfektion von Melanomzellen mit myristoyliertem und damit konstitutiv aktivem AKT1 (myrAKT1) zur Hochregulation der ULBP2 Proteinexpression. Dies konnte ebenfalls in Melanomzellen detektiert werden, die nach Transduktion myrAKT3 stabil exprimierten. Diese Daten demonstrieren, dass die Aktivität PI3K-abhängiger Signaltransduktionswege das NKG2DL Expressionsniveau bestimmt, wobei die Regulation der ULBP2 Expression zudem auch AKT-abhängig erfolgt. Dies verdeutlicht, dass MICA, MICB und ULBP2 durch PI3K- und AKT-abhängige Wege differentiell reguliert werden. Um gezielt die Auswirkung von Seneszenz auf die NKG2DL Expression zu ermitteln, wurde ein induzierbares Modell basierend auf der Melanomzelllinie WMM1175_p16INK4a verwendet. In diesen Zellen wird Seneszenz über die IPTG-induzierbare Expression von p16 initiiert. Der irreversible Proliferationsarrest der malignen Zellen wurde über die verstärkte Expression von Seneszenz-assoziierter β-Galaktosidase, einer Hochregulation von p16, Herabregulation von E2F-1 und Ki-67 sowie Zunahme von Autofluoreszenz verifiziert. Interessanterweise zeigten seneszente WMM1175_p16INK4a Zellen im Vergleich zu proliferierenden Kontrollzellen eine Induktion der NKG2DL MICA und MICB, während die ULBP2 Expression unbeeinflusst blieb. Im Gegensatz dazu führte replikative Seneszenz, induziert in Fibroblasten durch stetige Kultivierung, lediglich zu einer geringen Induktion der MICA und MICB Proteinexpression und einer leichten Herabregulation von ULBP2. Zusammenfassend demonstrieren die Resultate dieser Doktorarbeit, dass die Expression von MICA, MICB und ULBP2 sowohl im Melanom, als auch im Kolonkarzinom durch PI3Kabhängige Signaltransduktionswege reguliert wird. Entsprechend führt die PI3K Blockade zur Herabregulation der NKG2DL Expression, einhergehend mit einem Proliferationsstopp. Letzteres ist jedoch nicht zwangsläufig mit einer verminderten NKG2DL Expression assoziiert, da seneszente Melanomzellen eine Hochregulation von MICA und MICB aufweisen. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass sowohl die PI3K-vermittelte onkogene Proliferation als auch irreversibler Zellzyklusarrest im Kontext einer malignen Zelle, d.h. die Existenz „entarteter“ Zellen, dem Immunsystem via NKG2DL signalisiert werden.

Melanoma is the most dangerous type of skin cancer, originating from malignant transformation of melanocytes. Melanoma cells can be detected as abnormal self and eliminated by cytotoxic lymphocytes of the innate and adaptive immune system such as NK and T cells. Both lymphocyte subsets express the activating receptor NKG2D. Its stress inducible ligands, members of the MIC and ULBP molecule family, are expressed on tumor cells and signaling via NKG2D enhances the cytotoxic anti-tumor activity of T cells and NK cells. Though expression of the NKG2D ligands (NKG2DL) MICA, MICB and ULBP2 on melanoma cells has been demonstrated, their regulation by oncogenic signaling pathways remains to be elucidated. Melanoma cells are addicted to constitutive MAP-kinase pathway activation, frequently driven by mutant BRAFV600E and to oncogenic PI3K-AKT signaling both contributing to cell proliferation and survival. As PI3K inhibition effectively blocks proliferation of melanoma cells it is considered an interesting drug target for tumor therapy. The cell cycle arrest induced upon PI3K inhibition can either be transient or permanent, the latter associated with a senescent phenotype. Thus, the aim of this thesis was, at first, to analyse the impact of oncogenic PI3K and AKT signaling on NKG2DL expression and, at second, to determine the influence of senescence on NKG2DL expression. To assess whether PI3K dependent signaling pathways are involved in the regulation of NKG2DL expression in melanoma cells, different melanoma cell lines were treated with the PI3K inhibitor LY294002. This led to a decrease of MICA, MICB and ULBP2 surface expression independent of mutant BRAFV600E activity. NKG2DL downregulation was much stronger in the presence of the clinically relevant PI3K inhibitor GSK2126458. Compared to LY294002, blockade of PI3K dependent signaling by GSK2126458 was much more efficient even at lower concentrations as determined by the phosphorylation level of PI3K downstream targets such as AKT. Reduced NKG2DL expression was detectable within 4 hours after PI3K inhibition at the levels of surface protein, total protein and mRNA. Notably, inhibition of PI3K signaling decreased the NK cell sensitivity of melanoma cells. PI3K pathway inhibition has been demonstrated also to the induce activity of the tumor suppressor p53 indirectly via AKT. To study the role of p53 the PI3K-dependent regulation of NKG2DL expression, the syngenic HCT116 p53+/+ and HCT116 p53-/- colon carcinoma cell system was used. Both cell lines showed diminished cell surface, total protein and mRNA Expression of MICA, MICB and ULBP2 under PI3K blockade, though effects were stronger in the p53+/+ cell line. To analyse the role of AKT in regulating NKG2DL abundance, melanoma cells were exposed to the AKT Inhibitor GSK2110183. While blockade of AKT signaling had no consistent effects on MICA and MICB expression it consistently diminished ULBP2 expression at the cell surface, at the levels of total protein and mRNA. Also HCT116p53+/+ and HCT116p53-/- cells responded to AKT inhibition with a decrease in ULBP2 expression. Accordingly, transient transfection of melanoma cells with myristoylated AKT1 (myrAKT1), rendering AKT constitutively active, increased ULBP2 protein expression. These results were confirmed in myrAKT3 stably transduced melanoma cells. These data demonstrate that the activity of PI3K dependent signaling determines the NKG2DL expression levels. As only ULBP2 expression is consistently affected by AKT dependent pathways this points to a differential regulation of MICA, MICB and ULBP2 by PI3K and AKT dependent signaling. To assess the impact of senescence on NKG2DL expression the melanoma cell line WMM1175_p16INK4a was used as a model. In this cell line senescence via induction of p16 expression is inducible by IPTG. The irreversible cell cycle arrest was demonstrated by increased expression of senescence-associated β-galactosidase and p16, decreased E2F-1 and Ki-67 protein levels and elevated autofluorescence. Interestingly, senescence of WMM1175_p16INK4a cells was accompanied by an increase in the expression of MICA and MICB, while ULBP2 abundance was not affected. In contrast, replicative fibroblasts showed a slight increase in MICA as well as MICB and low reduction of ULBP2 expression. In sum the data of this PhD thesis demonstrate that expression of MICA, MICB and ULBP2 is regulated by PI3K dependent pathways, in melanoma and colon carcinoma. Accordingly, PI3K inhibition leads to downregulation of NKG2DL expression associated with a block in proliferation. The latter is not necessarily correlated with a diminished NKG2DL expression as senescent melanoma cells upregulate MICA and MICB expression. Thus not only oncogenic proliferation but also irreversible cell cycle arrest of malignant cells, i.e. the existence of “abnormal“ cells, is signalled via NKG2DL to the immune system.

Vorschau

Teilen und Zitieren

Zitierform:

Baingo, Jolanthe: Regulation der NKG2D Stressliganden MICA, MICB und ULBP2 in proliferierenden und seneszenten Tumorzellen. 2018.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Alle Rechte vorbehalten

Export