Functional organization of the CCAN protein complex
Kinetochores, huge proteinaceous scaffolds, assemble on centromeric chromatin and bind spindle microtubules to faithfully segregate sister chromatids during mitosis. The centromere - kinetochore interface is build by the constitutive centromere associated network (CCAN). CENP-C, a multi-functional CCAN protein, has been proposed to be one of the key players of kinetochore assembly. CENP-C is known to bind the outer kinetochore component Mis12 complex with its very N-terminus, its central domain is interacting with CENP-A nucleosomes, whereas its C-terminus has been suggested to be involved in CENP-A deposition. Although, dependency of several CCAN components on CENP-C for their kinetochore localization has been demonstrated, CENP-Cs role within CCAN assembly remains insufficiently understood. This study provides insights into organization of CENP-C within the CCAN, both by biochemical and structural approaches using recombinant material, but also within the context of human cells. It is clearly demonstrated that the N-terminal half of CENP-C is the assembly platform of the CCAN by directly recruiting the CENP-H/I/K/M and CENP-N/L complexes onto a region of CENP-C located between the Mis12 complex and the CENP-A binding sites. Point mutations within conserved patches of this CENP-C motif specfiically destroyed the CENP-C:CENP-H/I/K/M interaction, which was followed by a loss of CENP-N/L and CENP-T/W within human cells. CENP-T/W has proven to directly bind CENP-H/I/K/M in a previous study. A direct interaction of CENP-T/W with CENP-C was not observed. Taken together, CENP-C directly binds to CENP-H/I/K/M, that together provide a platform for CENP-N/L assembly. CENP-T/W indirectly depends on CENP-C through its interaction with the CENP-H/I/K/M complex. Therefore, CENP-C represents the only CCAN assembly interface within the kinetochore and thus displays a crucial component for kinetochore constitution.
Kinetochore sind gewaltige Proteingerüste, die sich auf centromerischem Chromatin zusammenbauen. Sie sind dafür verantwortlich Spindel-Mikrotubuli zu binden, um während der Mitose alle Schwesterchromatiden zuverlässig aufzutrennen. Das Centromer - Kinetochor Interface wird durch das konstitutive Centromer assoziierte Netzwerk (englisch centromere associated network (CCAN)) gebildet. CENP-C, ein multi-funktionales CCAN Protein, wurde als essentielle Komponente im Kinetochoraufbau vorgeschlagen. Es ist bekannt, dass der N-terminus von CENP-C die äußere Kinetochor Komponente Mis12-Komplex bindet, seine zentrale Domäne interagiert mit CENP-A Nukleosomen, wohingegen sein C-Terminus vermutlich an der Inkorporierung von neuen CENP-A Nukleosomen beteiligt ist. Obwohl demonstriert wurde, dass verschiedene CCAN Komponenten in ihrer Kinetochor Lokalisierung von CENP-C abhängen, ist die Rolle von CENP-C im CCAN Aufbau ungenügend verstanden. Diese Studie liefert Einsichten in die CENP-C Organisation innerhalb des CCANs, sowohl durch biochemische und strukturelle Methoden mittels rekombinantem Materials als auch im Kontext von humanen Zellen. Es wird klar demonstriert, dass die N-terminale Hälfte von CENP-C die Aufbauplattform des CCANs ist. Dabei bindet CENPC die CCAN Komplexe CENP-H/I/K/M und CENP-N/L in dem Proteinabschnitt zwischen der Mis12-Komplex und der CENP-A Bindungsstelle. Punktmutationen in konservierten Bereichen von diesem CENP-C Motiv zerstören spezifisch die CENP-C:CENP-H/I/K/M Interaktion, worauf ein Verlust von CENP-N/L und CENP-T/W an Kinetochoren in humanen Zellen folgt. Eine frühere Studie hat demonstriert, dass CENP-T/W direkt an CENP-H/I/K/M binden. Eine direkte Interaktion zwischen CENP-C und CENP-T/W konnte nicht gefunden werden. Zusammengenommen, bindet CENP-C direkt an CENP-H/I/K/M, welche zusammen eine Plattform für den CENP-N/L Aufbau bilden. CENP-T/W hängt indirekt von CENP-C ab, durch seine direkte Interaktion mit dem CENP-H/I/K/M Komplex. Deswegen stellt CENP-C das einzige Interface für den CCAN Aufbau dar und ist somit eine essentielle Komponente der Kinetochor Assemblierung.