Functional organization of the CCAN protein complex
Kinetochore sind gewaltige Proteingerüste, die sich auf centromerischem
Chromatin zusammenbauen. Sie sind dafür verantwortlich Spindel-Mikrotubuli zu binden, um während der Mitose alle Schwesterchromatiden zuverlässig aufzutrennen. Das Centromer - Kinetochor Interface wird durch das konstitutive Centromer assoziierte Netzwerk (englisch centromere associated network (CCAN)) gebildet. CENP-C, ein multi-funktionales CCAN Protein, wurde als essentielle Komponente im Kinetochoraufbau vorgeschlagen. Es ist bekannt, dass der N-terminus von CENP-C die äußere Kinetochor Komponente Mis12-Komplex bindet, seine zentrale Domäne interagiert mit CENP-A Nukleosomen, wohingegen sein C-Terminus vermutlich an der Inkorporierung von neuen CENP-A Nukleosomen beteiligt ist. Obwohl demonstriert wurde, dass verschiedene CCAN Komponenten in ihrer Kinetochor Lokalisierung von CENP-C abhängen, ist die Rolle von CENP-C im CCAN Aufbau ungenügend verstanden. Diese Studie liefert Einsichten in die CENP-C Organisation innerhalb des CCANs, sowohl durch biochemische und strukturelle Methoden mittels rekombinantem Materials als auch im Kontext von humanen Zellen. Es wird klar demonstriert, dass die N-terminale Hälfte von CENP-C die Aufbauplattform des CCANs ist. Dabei bindet CENPC die CCAN Komplexe CENP-H/I/K/M und CENP-N/L in dem Proteinabschnitt zwischen der Mis12-Komplex und der CENP-A Bindungsstelle. Punktmutationen in konservierten Bereichen von diesem CENP-C Motiv zerstören spezifisch die CENP-C:CENP-H/I/K/M Interaktion, worauf ein Verlust von CENP-N/L und CENP-T/W an Kinetochoren in humanen Zellen folgt. Eine frühere Studie hat demonstriert, dass CENP-T/W direkt an CENP-H/I/K/M binden. Eine direkte Interaktion zwischen CENP-C und CENP-T/W konnte nicht gefunden werden. Zusammengenommen, bindet CENP-C direkt an CENP-H/I/K/M, welche zusammen eine Plattform für den CENP-N/L Aufbau bilden. CENP-T/W hängt indirekt von CENP-C ab, durch seine direkte Interaktion mit dem CENP-H/I/K/M Komplex. Deswegen stellt CENP-C das einzige Interface für den CCAN Aufbau dar und ist somit eine essentielle Komponente der Kinetochor Assemblierung.
Kinetochores, huge proteinaceous scaffolds, assemble on centromeric chromatin and bind spindle microtubules to faithfully segregate sister chromatids during mitosis. The centromere - kinetochore interface is build by the constitutive centromere associated network (CCAN). CENP-C, a multi-functional CCAN protein, has been proposed to be one of the key players of kinetochore assembly. CENP-C is known to bind the outer kinetochore component Mis12 complex with its very N-terminus, its central domain is interacting with CENP-A nucleosomes, whereas its C-terminus has been suggested to be involved in CENP-A deposition. Although, dependency of several CCAN components on CENP-C for their kinetochore localization has been demonstrated, CENP-Cs role within CCAN assembly remains insufficiently understood. This study provides insights into organization of CENP-C within the CCAN, both by biochemical and structural approaches using recombinant material, but also within the context of human cells. It is clearly demonstrated that the N-terminal half of CENP-C is the assembly platform of the CCAN by directly recruiting the CENP-H/I/K/M and CENP-N/L complexes onto a region of CENP-C located between the Mis12 complex and the CENP-A binding sites. Point mutations within conserved patches of this CENP-C motif specfiically destroyed the CENP-C:CENP-H/I/K/M interaction, which was followed by a loss of CENP-N/L and CENP-T/W within human cells. CENP-T/W has proven to directly bind CENP-H/I/K/M in a previous study. A direct interaction of CENP-T/W with CENP-C was not observed. Taken together, CENP-C directly binds to CENP-H/I/K/M, that together provide a platform for CENP-N/L assembly. CENP-T/W indirectly depends on CENP-C through its interaction with the CENP-H/I/K/M complex. Therefore, CENP-C represents the only CCAN assembly interface within the kinetochore and thus displays a crucial component for kinetochore constitution.
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