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Funktionelle Analyse der Protease Taspase1 und ihrem Zielprotein Myosin1F

Kunst, Lena

Die Bedeutung von Proteasen für die medizinische und pharmazeutische Forschung ist wegen deren Beteiligung an vielfältigen (patho)biologischen Vorgängen unumstritten. Ein prominentes Beispiel ist die Threonin Protease Taspase1, die aufgrund ihrer Beteiligung an der Entstehung und Progression von MLL-vermittelten Leukämien sowie der erhöhten Expression in soliden Tumoren biomedizinische Relevanz erlangte. Die detaillierten molekularen Mechanismen und Signalwege über die Taspase1 ihre (patho)biologische Wirkung ausübt, sind jedoch noch unverstanden. Erst kürzlich konnte Myosin1F als Substrat der Taspase1 identifiziert werden. Myosine werden als Aktin-abhängige Motorproteine beschrieben, denen vielfältige Funktionen wie z. B. in der Zellbewegung zukommen. Bei Myosin1F handelt es sich jedoch um ein nur unzureichend charakterisiertes Protein. Es gibt jedoch ebenso wie für Taspase1 erste Hinweise auf eine Relevanz bei der Krebsentstehung. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die (patho)biologische Bedeutung des Taspase1-Myosin1F-Zusammenspiels sowie die Funktion des Myosin1F-Proteins untersucht. Um erste Informationen über die Genexpression zu erlangen, konnte erfolgreich eine qPCR-Methode für Taspase1 und Myosin1F etabliert werden. Diese bestätigte die erhöhte Taspase1-Expression in Tumorzelllinen und konnte ergänzend deutlich geringere Mengen Taspase1-mRNA in Immunzellen sowie die stark erhöhte Menge Taspase1-mRNA in adhärenten Zelllinien im Vergleich zu Suspensionszellen nachweisen. Der Vergleich der Myosin1F und Taspase1 mRNA-Mengen zeigte, dass die Taspase1-Expression weit über dem des Myosin1F liegt, jedoch in adhärenten Zellen mit der mRNA Expression von Myosin1F korreliert. In Immunzellen liegt hingegen ein gegenteiliger Trend vor. Folglich konnte die Genexpression von Myosin1F und Taspase1 als ein wichtiger Unterschied zwischen adhärenten und Suspensions-Tumorzellen identifiziert werden. Dies könnte sich auf Unterschiede im Migrationsverhalten der verschiedenen Zelltypen auswirken, da stark migrierende Zellen wie die des Immunsystems eine starke Migration jedoch kaum Adhäsion aufweisen. Expressionsstudien in Interphasezellen zeigten, dass Myosin1F und die nicht durch Taspase1 spaltbare Variante in Zytosol, an der Membran sowie am Zytoskelett lokalisieren. Analog dazu sind beide Proteine während der Mitose an der Zellmembran und bei Trennung der Tochterzellen zwischen diesen zu finden. Die Mutation in der Taspase1-Schnittstelle im Myosin1F resultiert ebenso wie die Erhöhung der Taspase1-Menge in einer stärker ausgeprägten zytoplasmatischen Lokalisation von Myosin1F. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Spaltung des Volllänge-Myosin1F-Proteins durch Taspase1 nachgewiesen und Hinweise auf die physiologische Bedeutung der Taspase1-Myosin1F-Wechselwirkung erarbeitet. Für diesen Nachweis wurde u.a. eine als „clevage-IP“ bezeichnete Methode etabliert, die im Folgenden zur Analyse spezifischer Enzym-Substrat-Spaltungen herangezogen werden kann. Interessanterweise konnte mit dieser Methodik nicht nur die dosisabhängige Enzymaktivität gezeigt werden, sondern eine getrennte Expression der Taspase1 - und -Untereinheiten resultierte in einer höheren Hydrolyseaktivität als eine entsprechende Expression des Volllänge-Proteins. Dies weist auf eine limitierende Funktion der intramolekularen cis-Spaltung hin. Weiterführend zeigte sich, dass das durch Spaltung entstehende C-terminale Myosin1F-Fragment stärker als das Volllängekonstrukt im Zytoplasma der Zelle lokalisiert. Das N-terminale Fragment akkumuliert dagegen im Zellkern. Untersuchungen des Spaltprodukts ergaben Hinweise auf ein schwaches, LMB-sensitives NES sowie die Interaktion der Spaltprodukte nach Spaltung des Myosin1F. Dies könnte den Transport des N-terminalen Fragments in den Zellkern regulieren, oder die Bildung eines Multiproteinkomplexes erlauben, wie es für das Taspase1-Substrat MLL bekannt ist. Funktionsanalysen konnten die Funktion des Myosin1F-Proteins in migratorischen Prozessen adhärenter Tumor- und Nicht-Tumorzellen nachweisen. So verstärkte eine ektope Myosin1F-Expression die Substratadhäsion, welche durch Integrin-stimulierende Substanzen beeinflussbar ist. Myosin1F kolokalisiert dabei mit Integrin und  sowie Rac1 und Cdc42 und interagiert mit Paxillin, Talin und Aktin. Da es sich bei diesen Proteinen um Marker der frühen fokalen Adhäsionen handelt, scheint Myosin1F dabei eine physiologische Funktion zu spielen. Die Kolokalisation mit Rac1 und Cdc42 deutet zudem auf eine Integrin-vermittelte Filopodienadhäsion zur Stabilisierung von Matrix-Adhäsionspunkten in den Lamellipodien hin. Weiterführend wurde die Beteiligung von Myosin1F an der PI3/Akt-Signalübertragung und die Interaktion mit Akt nachgewiesen sowie die EGF-abhängige Rekrutierung von Myosin1F an die Zellmembran aufgezeigt. Dabei wird die Ausbildung fokaler Adhäsionen scheinbar nicht direkt durch die Myosin1F-Menge in der Zelle beeinflusst, während hingegen die in der Zelle vorliegende Taspase1-Menge von Bedeutung für die Filopodienausbildung ist. Eine gesteigerte Zahl von Filopodien konnte bereits mit erhöhter Invasierung und damit einhergehend verstärkter Aggressivität und deutlich verminderter Überlebensrate in einer Vielzahl unterschiedlicher Krebserkrankungen in Verbindung gebracht werden. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Prozessierung von Myosin1F durch Taspase1 das Adhäsions- und das Migrationsverhalten von Zellen regulieren kann, was nicht nur bei Entwicklungsprozessen, sondern vor allem auch im Hinblick auf Metastasierung von Bedeutung ist. Die Daten weisen somit auf einen bis dato unbekannten (Patho)Mechanismus hin, über den Taspase1 durch Spaltung von Myosin1F das Metastasierungspotenzial solider Tumore beeinflussen kann.

The importance of proteases for the medical and pharmaceutical research is controversial because of their involvement in diverse (patho)biological processes. A prominent example is the threonine protease Taspase1 that attained biomedical relevance due to their involvement in the development and progression of MLL-mediated leukemias as well as the increased expression in solid tumors. In contrast to other proteases, the understanding of Taspase1’s (patho-) biological relevance and function is limited. Recently Myosin1F could be identified as a substrate of Taspase1. Myosins are described as actin -dependent motor proteins, involved in a variety of functions, such as cell movement. But the Myosin1F is a poorly characterized protein. However there is first evidence of relevance in carcinogenesis like for Taspase1. Therefore the (patho) biological significance of Taspase1-Myosin1F-interaction and the function of the Myosin1F protein were examined in this work. To obtain preliminary information on gene-expression a qPCR method for Taspase1 and Myosin1F could be successfully established. This confirmed the increased Taspase1 expression in tumor cell lines and in addition significantly smaller amounts Taspase1-mRNA in immune cells as well as the greatly increased amount Taspase1-mRNA in adherent cell lines compared to suspension cells. Comparison of Myosin1F and Taspase1-mRNA levels show that Taspase1-expression far exceeds that of the Myosin1F, but is correlated in adherent cell with the mRNA expression of Myosin1F. However, in immune cells is an opposite trend was shown. Consequently, the gene expression of Myosin1F and Taspase1 was identified as an important difference between adherent and suspension tumor cells. This could have an impact on differences in the migration behavior of the different cell types, as the strong migrating cells of the immune system shows strong migration but rarely adhesion. Expressionstudies in interphase cells showed that Myosin1F and the non-cleavable Taspase1-variant localize to the cytosol, the membrane and the cytoskeleton. Analogously, both proteins localize to the cell membrane during mitosis, and are found to concentrate between the daughter cells upon their separation. The mutation in the Taspase1 interface of the Myosin1F results, as well as increasing the Taspase1 amount, in a more pronounced cytoplasmic localization of Myosin1F. In this work, the cleavage of the full-length Myosin1F by Taspase1 protein was first shown and clues to the physiological significance of Taspase1-Myosin1F interaction developed. To analyze the Myosin1F-cleavage, a so called "clevage-IP" method were designated and established that can be used successively for the analysis of specific enzyme-substrate cleavage. Interestingly, with this method not only the dose-dependent enzyme activity was shown, but also the separate expression of Taspase1  - and  subunits resulted in a higher hydrolytic activity than a corresponding expression of the full-length protein. This points to a limiting function of the intramolecular cis-cleavage. Related experiments showed that the due to Taspase1-cleavage resulting C-terminal Myosin1F fragment more localized to the cytoplasm than the full-length construct. While the N-terminal fragment accumulate in the nucleus. Investigations of the cleavage product showed evidence of a weak, LMB-sensitive NES and the interaction of the cleavage-products after cleavage of the Myosin1F. This could regulate the transport of the N- terminal fragment into the nucleus or the formation of a multi-protein complex, as it is known for the Taspase1 substrate MLL. Functional analyzes have demonstrated the function of the Myosin1F-protein in migratory processes of adherent tumor and non-tumor cells. Thus, ectopic Myosin1F-expression results in the increased substrate adhesion, which is additional influenced by integrin-stimulating substances. Myosin1F co-localized with integrin  and  as well as Rac1 and Cdc42 and interacts with paxillin, talin and actin. Because these proteins are a marker of early focal adhesions, Myosin1F seems to play a physiological function thereby. The co-localization with Rac1 and Cdc42 also points to an integrin-mediated adhäsion of the Filopodien for stabilizing matrix adhesions in lamellipodia. Further the participation of Myosin1F in the PI3/Akt-Pathway and the interaction with Akt was detected as well as an EGF-dependent recruitment of Myosin1F to the cell membrane was demonstrated. The formation of focal adhesions is apparently not directly affected by the Myosin1F amount in the cell; while on the other hand, the present Taspase1 amount in the cell seems to be important to the Filopodiaformation. An increased number of filopodia was already linked with increased invasion and aggressiveness in a variety of cancers in combination with a significantly reduced survival. In summary, these results suggest that the processing of Myosin1F by Taspase1 can regulate the adhesion and the migration behavior of cells, which is not only of importance in developmental processes, but also with regard to metastasis. Thus the data indicate a so far unknown (patho)mechanism how cleavage of Myosin1F by the Taspase1 can influence the metastasispotential of solid tumors.

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Kunst, Lena: Funktionelle Analyse der Protease Taspase1 und ihrem Zielprotein Myosin1F. 2014.

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