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Functional analysis of multiple general transcription factors in Sulfolobus acidocaldarius

Rauch, Bernadette

The archaeal transcription machinery encompasses one multi-subunit RNA polymerase (RNAP), resembling the RNAPII of Eukaryotes, homologs of the TATA-binding protein (TBP), transcription factor TFIIB (TFB) and TFIIE-α (TFE) (Langer and Zillig, 1993, Marsh et al., 1994, Langer et al., 1995, Kyrpides and Ouzounis 1999, Bell and Jackson 1998a, b, Bell and Jackson, 2001, Hickey et al., 2002, Geiduscheck and Ouhammouch, 2005, Werner and Grohmann, 2011). The current mechanistic understanding of transcription initiation is that TBP binds to the TATA-box (~25 bp upstream of the transcription start site) whereupon TFB binds to the TBP-DNA complex forming sequence specific contacts with a purine-rich TFB-responsive element (BRE). Subsequently, the N-terminus of TFB recruits the RNAP to build the ternary pre-initiation complex. RNAP, TBP and TFB are solely sufficient for transcription of archaeal promoters in vitro (Bell and Jackson 1998a, b, Bell and Jackson, 2001, Hickey et al., 2002, Geiduscheck and Ouhammouch, 2005). Therefore archaeal transcription is generally regarded as a simpler model of the more complex eukaryal processes (Baliga et al. 2000). Whereas multiple tfb and tbp homologs have been deeply investigated in the euryarchaeal branch, the role of multiple GTFs in Crenarchaeota remains poorly understood. It has been proposed that various tfb homologs might serve like σ-factors in Bacteria and fulfill specialized functions according to stress response (Micorescu et al., 2008, Peng et al., 2009, Paytubi and White, 2009). The aim of this study was to provide multiple GTF proteins required for experiments like EMSAs and in vitro transcription and to gain a deeper insight into their function in S. acidocaldarius by the generation of reporter gene constructs, protein-protein interaction studies and generation of knock-out mutants. The thermoacidophile S. acidocaldarius grows optimally at 80°C and pH 2-3 (Brock et al., 1972) and is an obligate aerobic organism; it grows heterotrophically and requires a limited range of polysaccharides or amino acids (e. g. dextrin, starch, tryptone and glutamate) for growth (Grogan et al., 1989). The major advantage working with S. acidocaldarius, compared to other Crenarchaeota like T. tenax, is that a genetic system is established (Wagner et al., 2009, Wagner et al., 2012, Sakofsky et al., 2011). An expression system is available and markerless knock-out mutants can be generated. The function of TFB1 and TFB3 has only been investigated in few studies in Crenarchaeota (Bell and Jackson, 2000a, Götz et al., 2007, Paytubi and White, 2009). A first hint for the function of TFB2 was given by microarray studies and a cell-cycle dependent role was proposed (Lundgren and Bernander, 2011). However, TFB2 from S. acidocaldarius has not been characterized on protein level so far. The role of GTFs was investigated by expression of the proteins, reporter gene assays, protein-protein interaction studies with the RNAP and GTFs and knock-out mutant analysis for determination of in vivo function. Taken together this study provides an important basis (e.g. recombinant proteins, His-tagged RNAP, reporter gene constructs) for further experiments to unravel the function of GTFs in S. acidocaldarius and in Crenarchaeota. Furthermore an implication of TFB2 in transcription of RNA genes or RNA modification has been proposed and the function of TFB3 as co-activator was underlined.

Der archaeale Transkriptionsapparat umfasst eine aus mehreren Untereinheiten aufgebaute RNA Polymerase (RNAP), die der RNAPII von Eukaryonten ähnelt, sowie Homologe des TATA-Bindeproteins (TBP) und der Transkriptionsfaktoren TFIIB (TFB) und TFIIE (TFE) (Langer und Zillig, 1993, Marsh et al., 1994, Langer et al., 1995, Kyrpides und Ouzounis 1999, Bell und Jackson 1998a, b, Bell and Jackson, 2001, Hickey et al., 2002, Geiduscheck und Ouhammouch, 2005, Werner und Grohmann, 2011). Das momentane mechanistische Verständnis der Transkriptionsinitiation besagt, dass TBP an die TATA-box bindet (~ 25 bp stromaufwärts des Transkriptionsstarts). Anschließend bindet TFB an den TBP-DNA Komplex und bildet dabei sequenzspezifische Kontakte mit dem purinreichen TFB-responsive element (BRE). Daraufhin bindet die RNAP an den N-terminus von TFB um den prä-Initiationskomplex zu bilden. In vitro Studien zeigten, dass die RNAP, TBP und TFB für die Transkription archaealer Promotoren ausreichen (Bell and Jackson 1998a, b, Bell und Jackson, 2001, Hickey et al., 2002, Geiduscheck and Ouhammouch, 2005). Deshalb wird Transkription als vereinfachtes Modell für komplexere Transkriptionsvorgänge in Eukaryonten betrachtet (Baliga et al. 2000). Bei Euryarchaeota wurden multiple TFB und TBP Homologe bereits hinreichend untersucht wohingegen die Rolle multipler GTFS in Crenarchaeota weitestgehend unbekannt ist. Möglicherweise fungieren verschiedene TFB Homologe in ähnlicher Weise wie σ-Faktoren in Bakterien und führen eine spezialisierte Funktion als Stressantwort aus. (Micorescu et al., 2008, Peng et al., 2009, Paytubi and White, 2009). Ziel dieser Arbeit war es alle generellen Transkriptionsfaktoren von S. acidocaldarius, die für weitere Experimente wie EMSAs und in vitro Transkription benötigt werden zu exprimieren und zu reinigen, um schließlich die Funktion multipler Transkriptionsfaktoren mit Hilfe weiterer Experimente (Reportergenkonstrukte, Protein-Protein Interaktionsstudien, Knock-out Mutanten) aufzudecken. Der thermoacidophile Organismus S. acidocaldarius wächst optimal bei einer Temperatur von 80°C und einem pH von 2-3 (Brock et al., 1972) und ist obligat aerob. S. acidocaldarius wächst heterotroph und nur auf wenigen von Polysacchariden und Aminosäuren (Dextrin, Stärke, Trypton, Glutamat) (Grogan et al., 1989). Das bereits etablierte genetische System von S. acidocaldarius (Wagner et al., 2009, Wagner et al., 2012, Sakofsky et al., 2011), das ein Expressionssystem und die Generierung von Knock-out Mutanten umfasst, bietet einen großen Vorteil gegenüber der Forschung mit anderen Crenarchaeota wie T. tenax. Die Funktion von TFB1 und TFB3 wurde bislang nur in wenigen Crenarchaeota untersucht (Bell and Jackson, 2000a, Götz et al., 2007, Paytubi and White, 2009). Ein erster Hinweis auf eine Zellzyklus-abhängige Funktion von TFB2 wurde durch Microarray Studien aufgedeckt (Lundgren and Bernander, 2011). Jedoch wurde TFB2 von S. acidocaldarius bisher nicht auf Proteinebene untersucht. Die Rolle von GTFs in S. acidocaldarius wurde durch Expression der Proteine, Reportergen assays, Protein-Protein Interaktionsstudien mit der RNAP und GTFs sowie durch knock-out Mutanten für die Untersuchung der in vivo Funktion untersucht. Zusammenfassend ist zu sagen, dass diese Arbeit eine fundamentale Basis für weitere Experimente (z.B. rekombinante Proteine, His-Tag RNAP, Reportergen Konstrukte) bietet. Zudem wurde eine mögliche Rolle von TFB2 in Transkription von RNA Genen und RNA Modifikation dargelegt und die Funktion von TFB3 als Transkriptionsaktivator untermauert.

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Rauch, Bernadette: Functional analysis of multiple general transcription factors in Sulfolobus acidocaldarius. 2013.

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