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Aktivität und relative Schutzwirkung zweier konkurrierender DNA-Reparaturwege für O6-Methylguanin in vivo

Michele, Inga

Aufgrund ihres hohen zytotoxischen, mutagenen und karzinogenen Potentials sind DNA-Alkylierungen an der O6-Position des Guanins äußerst riskant sowohl für Zellen als auch für Organismen. Deshalb verfügen Säugerzellen über effiziente Reparaturmechanismen, über die diese kritischen Läsionen aus dem Genom entfernt werden können. Neben der gut untersuchten direkten De-Methylierung durch das MGMT-Protein ist kürzlich ein alternativer Exzisions-Reparaturweg für O6-meG in humanen Zellen entdeckt worden. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde nun geklärt, dass dieser Reparaturmechanismus auch in allen daraufhin untersuchten Primärzellen der Maus nachweisbar war und das die Proteine XPC und FancD2 dabei eine essenzielle Funktion hatten, während ein Verlust von XPA nur zu einer verlangsamten Exzisionsreparatur von O6-meG führte. Im Weiteren wurde analysiert, welche relative Schutzwirkung die beiden konkurrierenden Reparaturmechanismen unter in vivo-Bedingungen für das Risiko von biologischen Endpunkten wie Zelluntergang oder Tumorentstehung, haben. Dazu wurden Reparatur-profiziente und -defiziente Mäuse mit dem Alkylanz N-Methyl-N-Nitroseharnstoff (MNU) behandelt und die zytotoxische Auswirkung auf die Hämatopoese, dem Alkylierungs-sensibelsten Zellsystem der Maus, anhand der Myelosuppression im peripheren Blut registriert. Ferner wurde in Langzeituntersuchungen das Auftreten von malignen Veränderungen (Lymphomen) bei den MNU-exponierten Tieren analysiert. Der funktionelle Ausfall von XPC oder FancD2 führte, überaschenderweise unabhängig von der MGMT-Aktivität, zu einer signifikanten Verstärkung sowohl der Zytotoxizität bei hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (Myelosuppression) als auch der Karzinogenese (T-Zell-Lymphome). Demgegenüber zeigte ein Funktionsverlust der MGMT-vermittelten Reparatur oder des XPA-Proteins deutlich geringe Auswirkungen auf Ausmaß beziehungsweise Häufigkeit der beiden Endpunkte. Waren die Mäuse hingegen sowohl für MGMT als auch für XPA defizient, zeigten sie die mit Abstand höchste Suszeptivität für Zelluntergang und maligne Transformation nach MNU-Exposition. Bei der Bestimmung der Mutationsrate in Knochenmarkzellen der verschiedenen Mauslinien anhand einer transgenen lacZ-Sequenz fand sich eine etwa zehnfache Erhöhung dieser Werte nach MNU-Behandlung, aber kein signifikanter Unterschied bei An- oder Abwesenheit der beiden Reparaturfunktionen. Nach Sequenzanalyse des Indikatorgens zeigten sich jedoch bei den Reparatur-defizienten Mäusen Hinweise auf das vermehrte Auftreten von Punktmutationen, die von persistierenden O6-meG-Addukten herleitbar waren. Der hier in seiner biologischen Funktion erstmals näher charakterisierte alternative Exzisions-Reparaturweg ist offenbar nicht nur auf die Entfernung von Guanin-O6-Alkylierungen aus der DNA beschränkt, sondern greift beispielweise auch auf Cisplatin-induzierte Läsionen zu und hat höchstwahrscheinlich einen großen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit sowie auf das Nebenwirkungsspektrum von methylierenden Medikamenten in der Onkologie

The DNA alkylation damage O6-methylguanine (O6-meG) has a major biological impact on both individual cells and the whole organism due to its cytotoxic, mutagenic and carcinogenic potential. Mammalian cells posses very efficient repair mechanisms that can remove this critical lesion from the genome. In addition to the well-studied direct demethylation by the MGMT repair protein an alternative excision repair mechanism for O6-meG in human cells was identified recently. The first part of this thesis aimed to confirm that the alternative repair pathway is also active in various primary cell types of mice. The activity of the alternative repair pathway was shown to depend on the XPC (NER) and FancD2 (FA) proteins as essential factors for the excision repair of O6-meG-repair in vivo, whereas a loss of XPA only led to a slowed-down removal of O6-meG. Furthermore, this work addressed the relative contribution of both alternative repair mechanisms (MGMT and excision repair) to the protection from biological end points after MNU-exposure in vivo, such as cell death and tumor formation. Repair-proficient and –deficient mice were analyzed for the MNU-induced cytotoxicity in hematopoietic stem and progenitor cells by measuring the myelosuppression in the peripheral blood. In addition, the frequency of malignant alterations (occurrence of lymphoma) was monitored in MNU-exposed animals in long-term studies. In vivo analyses for MNU-induced cytotoxicity demonstrated the protective role of XPC and FancD2 for the hematopoietic system independent of MGMT-activity. Hematopoietic stem and progenitor cells of MNU-exposed XPC(-/-)- and FancD2(-/-)-mice exhibited more severe myelosuppression in comparison to wildtype or XPA(-/-)-mice. In parallel, the loss of functional XPC- or FancD2-protein led to reduced latency and increased frequency of lymphoma in MNU-exposed mice. However, the strongest hematotoxic and carcinogenic effects of DNA methylation were observed in mice with combined MGMT- and XPA-deficiency. The in vivo-mutation rates in lacZ-transgenic bone marrow cells of different mouse strains showed an up to 10-fold increase after exposure of MNU, with no significant difference between repair-deficient and wildtype mice and independent of pharmacological depletion of MGMT. However sequence analysis of the lacZ-gene in repair-deficient mice showed evidence of an increased occurrence of point mutations related to persisting O6-meG-adducts. Taken together, this work reveals some new biological functions of the alternative excision repair mechanism and gives insight into the molecular mechanism of this pathway. Preliminary adduct measurements of cisplatin-induced intrastrand crosslinks indicate that this system is not restricted to the repair of O6-G-alkylations, but is also essential for the removal of Pt (GpG)-lesions from DNA. The new findings may have an impact on the therapeutic effectiveness and on the biological side effects of methylating drugs in oncology.

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Michele, Inga: Aktivität und relative Schutzwirkung zweier konkurrierender DNA-Reparaturwege für O6-Methylguanin in vivo. 2013.

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