Antikörper-Selektive Materialien für die Produkt Aufreinigung : Gepfropfte PET- und Cellulose-basierte Makroporöse Membranadsorber

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Modifizierung von PET- und Cellulose-Membranen mit maßgeschneiderten Polymeren. Diese Modifizierung dient dazu, Gruppen einzuführen um eine selektive Bindung zu Immunglobulin G (IgG) zu erhalten. Zu diesem Zweck ist eine neue Methode zur UV-Pfropfung entwickelt worden. Bei dieser Methode wird ein „Typ I“ Photoinitiator kovalent auf der Membranoberfläche immobilisiert. Als Ausgangsmaterial für den Photoinitiator dient Benzoinethylether, welcher in die Photoinitiatoren 4-Ethoxy-5-oxo-4,5-diphenylpentanosäure und 4-Ethoxy-5-oxo-4,5-diphenylpentanosäurebromid umgewandelt werden konnte. Diese Initiatoren konnten dann kovalent an die PET- und Celluloseoberflächen gekoppelt werden. Ein Vergleichstest mit der etablierten „Synergist Immobilisierung“ zeigt, dass mit der neuen UV-Pfropfungsmethode ähnliche Pfropfdichten erreicht worden sind. Dazu wird aber deutlich weniger Photoinitiator benötigt, und die neuen Methoden zeigen auch noch eine bessere Reaktionskontrolle auf Oberflächen wie Cellulose. Auch konnte der Anteil an Nebenprodukten im Vergleich zur „Synergist Immobilisierung“ deutlich reduziert werden. Weiterhin konnte mit der neuen Methode die Dichte an Photoinitiator, durch die Zugabe von Benzoesäure bzw. Benzoesäurebromid, variiert werden, wobei die höchsten Photoinitiatordichten und damit zusammenhängend die höchsten Pfropfdichten, nicht bei 100% Photoinitiator Anteil erreicht worden sind. Zusätzlich ist es mit der neuen Methode möglich, die Struktur der Polymere zwischen Pilz-, Bürstenstruktur und „Kamm ähnlich“-Struktur zu wechseln. Für die „Kamm ähnlichen“-Strukturen sind die Membranen mit einen „Rückgrat“-Polymer versehen worden. Auf diesem „Rückgrat“-Polymer konnte dann noch einmal Photoinitiator immobilisiert und eine Pfropfung mit Monomeren durchgeführt werden. Mit der etablierten neuen Methode sind dann UV-Pfropfungen mit den maßgeschneiderten Monomeren durchgeführt worden. Dabei zeigt sich, dass die DG-Werte stark vom dem jeweiligen Monomeren bzw. Monomermischungen abhängen. So konnten Unterschiede im DG-Wert um den Faktor zwanzig gefunden werden, obwohl alle Monomere dieselbe Reaktivgruppe aufweisen. Weiterhin zeigen sich für die Copolymere größere DG-Werte als die Homopolymere. Aus diesem Grund sind alle weiteren Pfropf-Polymerisationen als Co-Polymerisationen mit dem „Abstandhalter“-Monomer 2-Hydr durchgeführt worden. Das verringert den Abstand zwischen reaktivsten und den unreaktiven Monomeren. Beim Vergleich der Pfropf-Polymerisationen zeigen sich auch Unterschiede zwischen PET-und Cellulose-Membranen. Diese Unterschiede basierten auf der Affinität der Monomere zu den Membranen. Wenn die Affinität der Monomere zum Membranmaterial groß ist, konnte die Polymerisation verbessert werden. Weiter zeigt sich in dieser Arbeit, dass die Möglichkeit den DG-Wert durch längere Reaktionszeiten oder einer höheren Monomerkonzentration zu beeinflussen, vom eingesetzten Monomer abhängt. Für einige Monomere zeigt der Pfropfungsgrad (DG) einen Grenzwert, während anderen Monomere solange eine Reaktion zeigen, bis das Monomer aufgebraucht ist. Verantwortlich dafür sind die Wechselwirkungen der Monomere untereinander. Mit den gepfropften Membranen sind Adsorptionstests durchgeführt wrden. Bei diesen Tests konnte die Kapazität der Membranen für IgG ermittelt werden. Dabei zeigt sich, dass die Beschichtung der Membranen einen starken Einfluss auf die IgG Kapazität hat, das Membranmatierial aber nicht. Die Tests ergeben nur für einige Beschichtungen eine Erhöhung der IgG-Kapazität, andere zeigen eine Verringerung der Kapazität und bei einigen Beschichtungen ist so gut wie kein Einfluss auf die Kapazität zu sehen. Die Membranen mit denen eine gute IgG-Kapazität erreicht werden konnte, sind dann mit Hilfe der Arbeitsgruppe von Prof. Schrader zu den besten Adsorbern weiterentwickelt worden. Diese besten Adsorber erreichten zwar keine hohen DG-Werte, aber dafür hohe IgG-Kapazitäten und hohe Affinitäten zum IgG. Im Vergleich zu konventionellen Ionenaustauschern zeigen die besten Adsorber deutlich höhere Affinitäten. Dabei konnten diese Affinitäten auf synergistische Effekte zurückgeführt werden. Nach den Adsorptionstests erfolgte die Bestimmung der IgG-Selektivität. Dazu sind erst Screening Tests mittels Elektrophorese durchgeführt worden. Diese zeigen, dass neben den besten Adsorbern nur wenige Beschichtungen eine IgG Selektivität aufweisen. Darunter sind die Ausgangsmischungen für die besten Adsorber und zwei konventionelle Ionenaustauscher. Unter strömenden Bedingungen sind dann nur noch Selektivitäten für die besten Adsorber festgestellt worden. Weiterhin zeigte sich, dass diese Membranadsorber unabhängig von ihrer Größe funktionierten. Die Membranen können dabei mit 5 mm Größe in einer Titerplatte funktionalisiert werden und es zeigt sich keinen Unterschied beim DG-Wert oder bei der IgG-Kapazität der Membranen. Weiterhin zeigt ein Vergleich, mit ebenfalls hergestellten MIPs, dass die DG-Werte der MIPs zwar größer sind als die der Membranen mit Aminosäure selektiven Monomeren, aber sowohl die Kapazität als auch die Selektivität der beiden Membranarten sind vergleichbar. In dieser Arbeit konnten daher Anitkörper-Selektive Membranen auf zweierlei Arten hergestellt werden.
In this work PET- and Cellulose based membranes are modified with tailor made Polymers. This modification inserts Groups that can bind selective to Immunoglobulin G (IgG). For that purpose a new UV-grafting method has been developed. This new method is based on a “type I” photo initiator that is immobilized covalently on the membrane surface. The base material for the photo initiator is Benzoinethylether, which has been converted to the initiators 4-Ethoxy-5-oxo-4,5-diphenylpentanoic acid and 4-Ethoxy-5-oxo-4,5-diphenylpentano-acidbromide. A comparative test with the established “synergist immobilization shows a similar degree of grafting (DG), but the needed amount of photo initiator has been much lower. As second aspect, a better reaction control for the Cellulose surface has been detected and a lower amount of side product has been found with the new method. Furthermore the new method allows varying the photo initiator density by adding Benzoic acid or Benzoybromide during the immobilization procedure. Additionally it is possible to control the structure of the polymer. The structure can be changed between “brush”, “mushroom” and “comb like” structures. For that “comb like” structures is a backbone polymer grafted. At this backbone polymer photo initiator is immobilized and again a grafting is done. With the now established new method grafting has been on the membrane surface with the tailor made monomers. The results of that grafting show that the DG depends on the used monomers and the monomers cause differences by the factor of twenty. These differences can be reduced by changing form homo-polymerisation to co-polymerisation. For that reason the most graft-polymerisations have been done with the “spacer”-monomer N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide. An influence of the base membrane can be seen to. These influences are based on the affinity of the monomers to the membrane surface. If the monomers show an affinity to the base membrane the polymerisation can be improved and the DG rises. More possibilities to affect the DG are a longer reaction time or a higher monomer concentration. How strong this affect is depends again on the used monomer. Some reactions will run until the whole monomer is used whereas some monomers show a maximum DG value. Repulsive interactions between the monomers are responsible for that behaviour. To get the IgG Capacity of the grafted membranes adsorption tests have been done. These tests show that the adsorption is strongly influences by grafted polymer but not by the base membrane. Furthermore the tests show that just a few polymers improve the IgG-capacity of the base membranes, some polymers have no influence and for some polymers the capacity decreases. The polymers with a good IgG-capacity have been enhanced in cooperation with the workgroup of Prof. Schrader to get the “best adsorber”. With these “best adsorbers” just a limited DG, but high capacities and high affinities can be reached. The affinities of the “best adsorbers” are significant higher than the affinities of conventional ionexchanger and can be explained by synergistic effects. Subsequent to the adsorption tests the IgG-selectivities have been measured. To get an imagination of what polymers has IgG-selectivity, a screening test via electrophoresis has been done. The test shows an IgG-selectivity just for the “best adsorbers”, the starting polymers of the “best adsorbers” and for two of the conventional ionexchanger. At dynamic conditions IgG-selectivities can be seen just for the “best adsorbers”. Further studies show that the membraneadsorbers work independent form its size. These membranes can be produced in a well plate with a size of 5 mm and there in no difference in DG or in the IgG-capacity. A comparison with self made MIPs shows that the MIPs have a higher DG than the tailor made polymers, but the IgG-capacity and selectivity are comparable. So in this work to different types of antibody-selective membranes could have been produced.

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