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Expression and function of the fat mass and obesity-associated gene FTO

Berulava, Tea

Genome-wide association studies have revealed a strong association between a block of single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in intron 1 of the fat mass and obesity-associated (FTO) gene, body mass index (BMI) and other obesity-related traits in children and adults of many different populations. Yet, the impact of these variations on expression of FTO and/or other genes has remained unknown. Moreover, the biological function of FTO, in particular its contribution to body weight regulation, is still a subject of extensive investigations. The aim of this thesis was to investigate the impact of FTO genotype on FTO expression and elucidate the function of the FTO protein by determining its subcellular localization and the effect of FTO dosage on RNA expression profiles and RNA modification levels. Hence, expression studies were performed to evaluate the link between obesity-associated SNPs and expression of FTO and/or other genes, and functional studies were performed to gain insight into FTO biology. Allelic expression studies by primer extension assays were carried out to address the question whether obesity-associated variation affects transcription of the FTO and/or other genes in cis. It was demonstrated that the risk allele of FTO makes about 40% more transcripts than the non-risk allele in the different cell types. Characterization of single polymorphisms with regard to their location (in silico approach) and protein binding activity pointed to a complex regulation of the expression of FTO. This was strengthened by the fact that the cellular the level of FTO mRNA is controlled by a number of transcription factors. Allelic expression of the neighboring RPGRIP1L and RBL2 was shown to be independent of the FTO genotype.
To elucidate the function of the FTO protein, effects of its altered levels on the transcriptome and RNA methylation were investigated. Overexpression of FTO resulted in changes of steady state levels of genes involved in RNA processing and metabolism, whereas deficiency of FTO led to alterations in transcripts levels of genes determining cellular response to starvation. Subcellular localization studies showed that FTO is enriched in nuclear speckles, where RNA splicing factors are stored and modified, and is present in nucleoli, where ribosomal RNA is transcribed and processed. In vitro studies have suggested that FTO acts as a nucleic acid demethylase and prefers single stranded RNA as a substrate. Therefore, the effects of FTO on RNA methylation were investigated. By comparison of content of modified and non-modified ribonucleosides in total brain RNA of Fto-deficient and wild type mice I could show that the level of FTO affects the 3-methyluridine/uridine and pseudouridine/uridine ratios.
In summary, I could show that increased expression of FTO predisposes to obesity, possibly by affecting transcriptome and RNA modifications. Further investigations will help to elucidate the link between FTO function, RNA processing and obesity.

Genomweite Assoziationsstudien haben eine starke Assoziation zwischen einem Block von Einzelnukleotid Variationen (single nucleotide polymorphisms - SNPs) im Intron 1 des Fettmasse und Adipositas-assoziierten Gens (FTO), dem body mass index (BMI) und anderen, Adipositas bezogenen Erkrankungen bei Kindern und Erwachsenen vieler verschiedener Populationen gezeigt. Dennoch ist bisher nicht bekannt, wie stark der Effekt dieser Variationen auf die Expression von FTO und/oder anderen Genen ist. Darüber hinaus ist die biologische Funktion von FTO, insbesondere in Bezug auf die Regulation des Körpergewichts, noch immer Gegenstand intensiver Forschung. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Effekts des FTO Genotyps auf die Expression von FTO sowie die Aufklärung der Funktion des FTO Proteins durch Bestimmung der subzellularen Lokalisation und des Effekts der FTO Dosis auf RNA Expressionsprofile und RNA Modifizierungslevel. Daher wurden Expressionsstudien durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen Adipositas-assoziierten SNPs und der Expression von FTO und/oder anderen Genen zu untersuchen sowie funktionelle Studien, um Einblick in die Biologie von FTO zu erlangen.
Um die Frage zu klären, ob Adipositas-assoziierte Variationen die Transkription von FTO und/oder anderen Genen in cis beeinflussen, wurden Allel-spezifische Expressionsstudien mittels Primer-Extensions Assays genutzt. In verschiedenen Zelltypen konnte gezeigt werden, dass vom Risiko-Allel des FTO Gens ca. 40% mehr Transkript generiert wird als vom Nicht-Risiko-Allel. Die Charakterisierung einzelner SNPs im Hinblick auf ihre Lokalisation (in silico Ansatz) und Proteinbindeaktivität wies auf eine komplexe Regulation der FTO Expression hin. Dies wurde auch durch die Tatsache unterstützt, dass der zelluläre FTO mRNA Level durch eine Reihe von Transkriptionsfaktoren kontrolliert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Allel-spezifische Expression der benachbarten Gene RPGRIP1L und RBL2 unabhängig vom FTO Genotyp ist.
Zur weiteren Klärung der Funktion des FTO Proteins, wurde der Effekt eines veränderten Protein Gehalts von FTO auf das Transkriptom und die RNA Methylierung untersucht. FTO Überexpression führte zu Veränderungen der steady-state Level von Genen, die bei der RNA Prozessierung und Metabolisierung eine Rolle spielen. Ein Mangel an FTO andererseits wirkte sich auf die Transkriptlevel von Genen aus, die bei der Zellantwort auf Nährstoffmangel beteiligt sind. Untersuchungen zur subzellularen Lokalisation zeigten, dass FTO vermehrt in nuclear speckles (punktförmigen Gebilden im Zellkern) vorkommt werden konnte, in denen RNA Spleißfaktoren gespeichert und modifiziert werden. Außerdem ist FTO in den Nucleoli vorhanden, wo ribosomale RNA transkribiert und prozessiert wird. In vitro Studien hatten Hinweise darauf geliefert, dass FTO als Nukleinsäure Demethylase agiert und dabei Einzelstrang RNA als Substrat bevorzugt. Daher wurden die Effekte von FTO auf RNA Methylierung untersucht. Durch den Vergleich des Gehalts von modifizierten und nicht-modifizierten Ribonukleosiden in RNA aus Gehirn von Fto-defizienten und Wildtyp Mäusen, konnte gezeigt werden, dass der FTO Gehalt das Verhältnis von 3-Methyluridin/Uridin and Pseudouridin/Uridin beeinflusst.
In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass eine erhöhte Expression von FTO eine Prädisposition für Adipositas darstellt, möglicherweise durch Einfluss auf das Transkriptom und RNA Modifizierung. Weitere Untersuchungen werden dabei helfen, den Zusammenhang zwischen der Funktion von FTO, RNA Prozessierung und Adipositas weiter aufzuklären.

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Berulava, Tea: Expression and function of the fat mass and obesity-associated gene FTO. 2013.

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