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NOV(CCN3)-vermittelte Signalkaskaden zur Regulation der Migration und Proliferation der humanen Trophoblastzelllinie Jeg3

Wagener, Jessica

Die Migration und Invasion des extravillösen Trophoblasten in das maternale Kompartiment, die Dezidua, ist eine Grundvoraussetzung für die Entwicklung der Plazenta, die den Stoffaustausch zwischen maternalem und fötalem Blutkreisklauf gewährleistet. Die extravillösen Trophoblastzellen bewirken eine Umwandlung der maternalen Spiralarterien in der Dezidua zu elastisch erweiterten Gefäßen mit geringem Widerstand, was zu einer erhöhten Durchflussleistung des Blutstroms führt und so die Versorgung des Embryos mit Sauerstoff und Nährstoffen garantiert. In der schwangerschaftsbedingten Erkrankung Präeklampsie ist dieser Vorgang der Trophoblastinvasion gestört, wodurch es zu einer Unterversorgung des Embryos und daher häufig zu einer intrauterinen Wachstumsretardierung kommt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des CCN-Proteins NOV (CCN3), welches in extravillösen Trophoblastzellen exprimiert wird, bei der Regulation der Proliferation und der Migration/Invasion des humanen extravillösen Trophoblasten am Modell der malignen Trophoblastzelllinie Jeg3 untersucht. Dabei lag ein besonderer Fokus auf der Entschlüsselung der Signalwege, über die NOV verschiedene Prozesse wie Proliferation und Migration/Invasion in Jeg3 Zellen steuert. Es wurden zwei verschiedene Glykosylierungsformen von NOV in stabil transfizierten Jeg3 Zellen identifiziert: eine 48 kDa unglykosylierte intrazelluläre Form sowie eine 55 kDa N-glykosylierte sezernierte Form. Funktionsanalysen von NOV-überexprimierenden Jeg3 Zellen zeigten ein signifikant reduziertes Wachstumsverhalten im Vergleich zu Kontrollzellen, wohingegen die Migrationsraten signifikant erhöht waren. Um die beiden in Jeg3 Zellen vorkommenden NOV-Formen unabhängig voneinander auf ihre individuelle biologische Funktion hin analysieren zu können, wurden parentale Jeg3 Zellen mit glykosyliertem bzw. unglykosyliertem rekombinantem NOV stimuliert. Dabei stellte sich heraus, dass die migrationsfördernde Wirkung von NOV ausschließlich von der unglykosylierten Form vermittelt wird, wohingegen die antiproliferativen Eigenschaften von NOV unabhängig vom Glykosylierungsstatus des Proteins sind.
Die Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismen der NOV-induzierten Prozesse in Jeg3 Zellen zeigte eine Beteiligung der PI3K/Akt- und der MAPK/ERK-Signalkaskade, die beide unabhängig voneinander durch NOV aktiviert wurden. Durch siRNA-Analysen konnte Integrin α5β1 als Rezeptor für NOV identifiziert werden, der die migrationsfördernde Wirkung von unglykosyliertem NOV über die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges vermittelt. Eine NOV-abhängige Hochregulierung der Expression von Matrixmetalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 auf mRNA Ebene, eine erhöhte Aktivierung von MMP-2 , sowie eine verstärkte Sekretion von ADAM-12 durch unglykosyliertes NOV gaben Hinweise auf die Rolle dieses CCN-Proteins in der Trophoblastinvasion. Es wurde außerdem ein zweiter Integrin α5β1-unabhängiger Signalweg gefunden, der die Migration über die Aktivierung der MAP Kinasen ERK1 und ERK2 steuert. Der Rezeptor, der die NOV-abhängige Proliferationsreduktion vermittelt, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht identifiziert werden.
Die Glykosylierung von NOV in Plazentagewebe, Blutserum und Urin von Präeklampsie-Patientinnen korrelierte nicht mit der Diagnose dieser schwangerschaftsbedingten hypertensiven Erkrankung. Jedoch zeigte sich eine signifikante Erhöhung des NOV-Proteins im Serum von late-onset Präeklampsie-Patientinnen.
Die Untersuchungen an Jeg3 Trophoblastzellen zeigten eine wichtige Rolle der NOV-Glykosylierung im Hinblick auf die Balance zwischen der Proliferation und der Migration/Invasion des Trophoblasten. So könnte eine Fehlregulation von unglykosyliertem und glykosyliertem NOV mit Veränderungen in der Trophoblastfunktion, also einem Ungleichgewicht in der Proliferation und Migration/Invasion, verbunden sein. Dieses Ungleichgewicht könnte zu der in der Präeklampsie beobachteten mangelnden Invasion des Trophoblasten beitragen.

Migration and invasion of the extravillous trophoblast into the maternal decidua is a prerequisite for placental development. Extravillous trophoblast cells remodel maternal spiral arteries by replacing endothelial cells and converting them into vessels with low resistance and therefore high blood flow capacity. This process is essential for the nutrition of the embryo.
In this study we used the malignant trophoblast cell line Jeg3 as a model for the early invasive placental trophoblast to investigate the role of the matricellular CCN protein NOV (CCN3) in regulating trophoblast migration and proliferation properties. Stably transfected Jeg3 cells expressed an intracellular non-glycosylated - and a secreted N-glycosylated form of NOV. Additionally the non-glycosylated NOV was found in placental tissue, serum and urine of pregnant women. ELISA analyses revealed a significant upregulation of NOV in the serum of women suffering from late-onset preeclampsia.
We used two different forms of recombinant NOV, non-glycosylated and glycosylated, and investigated their impact on Jeg3 migration and proliferation properties. Our data revealed a NOV-dependent decrease in proliferation independent from the NOV glycosylation status and an increase in migration properties of Jeg3 cells mediated only by non-glycosylated NOV. To understand the basic molecular mechanisms underlying these NOV-mediated processes we analysed the PI3K/Akt- and the MAPK/ERK signalling cascade in Jeg3 cells upon treatment with recombinant NOV. Both pathways were activated upon stimulation with glycosylated and non-glycosylated NOV respectively. Knockdown of integrin α5 expression revealed that unglycosylated NOV-stimulated trophoblast cell migration - but not the NOV-dependent decrease in proliferation - is mediated by activation of PI3K/Akt signalling via Integrin α5β1. NOV-dependent upregulation of the matrixmetalloproteinases MMP-2 and -9, increased activity of MMP-2 and enhanced secretion of ADAM-12 revealed the involvement of NOV in invasion processes. Taken together our data show that the balance of glycosylated and non-glycosylated NOV might contribute to the regulation of trophoblast functions which may provide insights in the pathogenesis of preeclampsia in respect to impaired invasiveness of trophoblast cells.

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Wagener, Jessica: NOV(CCN3)-vermittelte Signalkaskaden zur Regulation der Migration und Proliferation der humanen Trophoblastzelllinie Jeg3. 2011.

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