Humanisierung und funktionelle Charakterisierung eines gegen Herpes Simplex Viren Typ-1 und Typ-2 (HSV-1 und HSV-2) gerichteten murinen monoklonalen Antikörpers

Krawczyk, Adalbert

Herpes Simplex Viren sind weltweit verbreitet und gehören zu den häufigsten viralen Infektionserregern. Reaktivierungen dieser lebenslang im Wirtsorganismus persistierenden Viren sind insbesondere bei Patienten mit einer schweren Immunsuppression mit lebensbedrohlichen Komplikationen assoziiert. Der dadurch notwendige häufige und langandauernde Einsatz etablierter Virustatika führt zu einer zunehmenden Ausbildung resistenter Virusstämme, die eine rasch fortschreitende, generalisierte Infektion mit tödlichem Verlauf zur Folge haben können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der gegenüber HSV-1 und HSV-2 hochwirksame murine monoklonale Antikörper mAk 2c für eine spätere Anwendung beim Menschen präklinisch evaluiert. Die Untersuchungen der funktionellen Eigenschaften der Antikörperfragmente 2c-F(ab´)2, 2c-Fab und 2c-scFv im direkten Vergleich zum parentalen mAk 2c zeigten, dass die Antikörpervalenz für die antivirale Wirksamkeit des Antikörpers von entscheidender Bedeutung war. Die bivalenten Antikörper mAk 2c und 2c-F(ab´)2 zeichneten sich im Gegensatz zu den monovalenten Antikörper-Fragmenten 2c-Fab und 2c-scFv durch eine extrem effiziente Virusneutralisation aus und konnten den „cell-to-cell spread“ wirksam inhibieren. Im Gegensatz zur Maus werden beim Mensch Antikörper mit dieser Spezifität nicht gebildet. Da murine Antikörper für den Menschen immunogen sind, wurde die Immunogenität des mAk 2c durch Humanisierung nahezu vollständig eliminiert. Die funktionellen Eigenschaften des parentalen mAk 2c konnten dabei vollständig erhalten werden. Bereits die durch alleiniges CDR-Grafting generierte humanisierte Variante mAk hu2c V1 wies eine zum mAk 2c vergleichbare Affinität auf und war zur gleichermaßen effizienten Virusneutralisation sowie Inhibition des „cell-to-cell spreads“ in der Lage. Darüberhinaus konnte die antivirale Wirksamkeit des mAk hu2c V1 an einem breiten Kollektiv von klinischen HSV-1/HSV-2 Isolaten ohne oder mit nachgewiesener Virustatika-Resistenz sowie Laborstämmen demonstriert werden. Sämtliche der untersuchten Isolate wurden durch den humanisierten Antikörper mit derselben Effektivität neutralisiert wie die Laborstämme des entsprechenden Typs. Die Untersuchung des Neutralisationspotentials des mAk hu2c V1 im NOD/SCID-Mausmodell zeigte erstmals, dass die alleinige Antikörpergabe ohne zusätzliche Aktivierung von Immun-Effektorfunktionen einen wirksamen Schutz vor einer sonst tödlich verlaufenden Infektion vermittelt. Abschließend wurde die Fähigkeit des mAk hu2c V1 zur Neutralisation des gegenüber etablierten Virustatika multiresistenten Isolates HSV-1 R10.2 im Tiermodell untersucht. Die Gabe des humanisierten Antikörpers im Zuge einer postexpositionellen Immunprophylaxe führte im Gegensatz zur Behandlung mit Aciclovir zu einer wirksamen Eliminierung der Infektion und zum vollständigen Schutz der immunsupprimierten Versuchstiere vor einem letalen Infektionsverlauf. Die im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich durchgeführte Humanisierung des anti-HSV-Antikörpers stellt eine vielversprechende Grundlage für die klinische Weiterentwicklung dieses Antikörpers als eine äußerst wirksame Virustatikum-Alternative zur Prophylaxe und Therapie von Herpes Simplex Infektionen dar.

Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) and type 2 (HSV-2) are widely spread viruses in adults. After primary lytic infection, HSV establishes a lifelong latent infection followed by periodical recurrence. Aciclovir (ACV), Foscarnet and Cidofovir are the drugs of choice for the treatment of acute HSV infections. However, in immunocompromized individuals like HIV/AIDS patients or transplant recipients, increasing occurrence of ACV- and multiresistant HSV is associated with severe life-threatening infections. Human anti-HSV-antibodies generated after primary infection are essential for the establishment of the latent infection, but do not inhibit the virus proliferation or the HSV-typical cell-to-cell spread. Thus, development of novel drugs for overcoming HSV drug resistance is of great importance. In the current work, the murine monoclonal antibody mAb 2c, which proved to be extremely effective in suppression of HSV infections in mice, was evaluated as a novel compound to overcome resistant HSV-infections. Furthermore, it could be demonstrated that antibody valency has a major effect on antiviral efficiency. The bivalent antibodies mAb 2c and F(ab)2 fragments were extremely efficacious in clearance of free virus and inhibition of the cell-to-cell spread, while monovalent 2c-Fab and 2c-scFv fragments induced a 300 fold lower neutralization and were not capable to block viral cell-to-cell spread. Major impediment to the clinical utility of murine antibodies is their potential to elicit human anti-murine antibody response in patients. Thus, the immunogenic potential of mAb 2c was eliminated by a new humanization approach. The creation of the humanized mAk hu2c V1 was accomplished by inserting the appropriate CDR coding segments, responsible for the desired binding properties, into a human antibody "scaffold". The affinity, the virus neutralization and the cell-to-cell spread inhibition results showed that the humanized antibody mAb hu2c V1 retained the biological properties of the parental murine monoclonal antibody. Furthermore, mAb hu2c V1 showed extraordinary neutralization efficiency towards ACV- and multiresistant HSV-1 and HSV-2 strains in vitro. Finally, it could be shown that mAb hu2c V1 was capable to eliminate virus from the vaginal mucosa and to prevent severe immunodeficient NOD/SCID mice from a lethal outcome of HSV-infection. In contrast to ACV, the humanized antibody efficiently neutralized the multiresistant (ACV, PFA, CDV) HSV-1 R-10.2 strain in NOD/SCID mice. Thus, the obtained data hold great promise for the further development of mAb hu2c V1 as an alternative drug for HSV therapy.

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Krawczyk, Adalbert: Humanisierung und funktionelle Charakterisierung eines gegen Herpes Simplex Viren Typ-1 und Typ-2 (HSV-1 und HSV-2) gerichteten murinen monoklonalen Antikörpers. 2010.

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