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Strukturelle Charakterisierung von pGolemi, einem hochaffinen, synthetischen Mena EVH1-Liganden

Link, Nina

EVH1-Domänen sind polyprolinbindende Domänen, welche in einer Vielzahl von Adapterproteinen vorkommen; unter Anderem auch in Ena/VASP-Proteinen, deren Aufgaben in der Umgestaltung des Aktin-Skeletts der Zelle und der korrekten Führung der Axonfortsätze liegen. Ena/VASP-Proteine haben eine konservierte Domänen¬zusammensetzung mit einer aminoterminalen EVH1-Domäne, über welche die korrekte Lokalisierung der Adapterproteine vermittelt wird, einem prolinreichen Abschnitt und eine EVH2-Domäne. Die Wechselwirkung eines Transmembranproteins des Krankheits¬erregers Listeria monocytogenes mit diesen EVH1-Domänen ist essentiell für die Rekrutierung des Aktinskeletts in der Wirtszelle, welche wiederum die Grundlage für die Infektivität dieses Pathogens ist. In dieser Arbeit wurde die Struktur eines synthetischen, hochaffinen Mena EVH1-Liganden, pGolemi, mit Hilfe der NMR-Spektroskopie gelöst und Strukturmodelle der Mena EVH1-Domäne mit pGolemi und einem natürlichen Liganden erstellt. Die Struktur des Peptids entspricht der Faltung von pankreatischen Peptiden, weist aber im Amino¬terminus grundlegende Unterschiede in der Konformation und der Stabilisierung des charakteristischen hydrophoben Kerns auf. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass das Wechselspiel zwischen räumlicher Fixierung und Flexibilität für die hohe Affinität an die Mena EVH1-Domäne verantwortlich ist. In Kombination mit den erstellten Homologiemodellen und früheren Arbeiten konnten zusätzliche Bindungsdeterminanten der EVH1-Domänen aufgedeckt werden und zudem starke Hinweise für einen nicht-klassischen Bindungsmechanismus für pGolemi unter Beteiligung der amphipathischen Helix gewonnen werden. Zusätzlich wurde ein Strukturmodell eines synthetischen Domänenmimikrys angefertigt, das auf eine suboptimale oder nichtproduktive Bindung an pGolemi hinweist. Ähnliche Ergebnisse wurden über NMR-spektroskopische Untersuchung des Komplexes erhalten. Diese Erkenntnisse werden die Erstellung von weiteren hochaffinen und paralog-spezifischen EVH1-Liganden erheblich vereinfachen. Sie können als Grundlage für die Untersuchung der molekularen Aufgaben dieser Domänen in der Zelle dienen und so zu einem besseren Verständnis der Aktinpolymerisierung beitragen.

EVH1 domains are polyproline binding domains that are present in a wide range of adaptor proteins, among them Ena/VASP proteins involved in actin remodeling and axonal guidance. The interaction of ActA, a transmembrane protein from the food-borne pathogen Listeria monocytogenes, with EVH1 domains has been shown to be crucial for recruitment of the host´s actin skeleton and, as a consequence, for the infectivity of this bacterium. In the course of this work, I solved the structure of a synthetic high-affinity Mena EVH1 ligand, pGolemi, capable of paralog specific binding, by NMR spectroscopy. This peptide shares the common pancreatic peptide fold with its scaffold, aPP, but shows pivotal differences in the amino terminus. The interplay of spatial fixation and flexibility appears to be the reason for its high affinity towards Mena EVH1. In addition, homology models of pGolemi and a natural ligand, PRII, in complex with Mena EVH1 were built. Combined with earlier investigations, the gained structural data shed light on the specificity determinants of pGolemi and the importance of additional binding epitopes on EVH1 domains regulating paralog specificity. Furthermore, strong evidence for a non-classical binding mechanism by participation of the amphipathic helix in pGolemi could be gathered. With these results, the design of other high-affinity, paralog-specific EVH1 domain ligands is expected to be facilitated enormously, and serve as a fundament for the investigation of the molecular mode of action of EVH1 domains.

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Link, Nina: Strukturelle Charakterisierung von pGolemi, einem hochaffinen, synthetischen Mena EVH1-Liganden. 2009.

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