Entwicklung eines Lab-on-a-Chip Systems zur zerstörungsfreien Einzelzellprofilierung potentieller Tumorzellen anhand affinitätsbasierter Wechselwirkungen zellspezifischer Oberflächenmarker
Grundlage dieses Promotionsprojektes war die Weiterentwicklung eines Lab-on-a-Chip Systems zur Einzelzelluntersuchung mit dem Fokus auf die Profilierung zirkulierender Tumorzellen (circulating tumor cells- CTC). Durch Vorarbeiten bestand ein Proof of concept, welches die Verlangsamung von Kulturzellen in Reaktion auf affinitätsbasierte Wechselwirkungen mit Aptameren innerhalb eines mikrofluidischen Kanals nachwies. Die Durchführung beruhte dabei allerdings auf einer manuellen Vermessung der Zellgeschwindigkeit sowie Druckkontrolle in einem sehr kleinen Kanal von 20 x 20 µm (B x H), wobei der Kanal zur Hälfte mit nur einem Aptamer/einer Konzentration beschichtet werden konnte.
Ziel des Projektes war somit die Maßstabvergrößerung und Halb-automatisierung des Systems, die zielgenaue Immobilisierung verschiedener Antikörper bzw. Antikörperkonzentrationen innerhalb eines Kanals sowie die Reproduzierung der Zellverlangsamung mit unterschiedlichen Zelllinien und Translation zu der Verwendung von Patientenproben. Zunächst konnte mit der Behandlung mit Sauerstoffplasma und anschließender Funktionalisierung des Polymethylmethacrylats (PMMA) mit Neutravidin über Carbodiimid-Chemie eine stabile Funktionalisierung mit hoher Proteinbindekapazität geschaffen werden. Durch Anwendung eines Microarray Spotters und Lösung der Antikörper in Polyvinylalkohol-Puffer (PVA) gelang eine exakte Immobilisierung der Antikörper innerhalb des Kanals, die eine spezifische Anhaftung von Zellen an den beschichteten Bereichen hervorrief. Dabei bleibt die Beschichtung anpassungsfähig an geänderte Chip-/Kanalgeometrien. Die affinitätsbasierte, spezifische Haftung der Zellen an den Antikörper-beschichteten Bereichen konnte durch den Vergleich der Genexpressionsmuster per quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qrt-PCR) und Immunfluoreszenz bestätigt werden. Recht niedrige Wiederfindungsraten bei allen Zellversuchen im Chip sind auf die Chipgeometrie zurückzuführen, die durch einen eigenen Chip vermeidbar wären. Unter anderem auch auf technische Schwierigkeiten mit dem Detektionssystem ist zurückzuführen, dass das Zell-Rollen nicht reproduziert werden konnte. Verbesserung der Software, Verwendung anderer Antikörper und Zelllinien sowie eine eventuelle Mischung der Antikörper mit Selektinen, könnten in zukünftigen Versuchen Ansatzpunkte für eine Lösung sein.
The basis of this PhD project was the further development of a lab-on-a-chip system for single cell investigation with a focus on profiling circulating tumor cells (CTC). Through preliminary work, a proof of concept existed that demonstrated the slowing of culture cells in response to affinity-based interactions with aptamers within a microfluidic channel. However, the implementation here was based on manual measurement of cell velocity as well as pressure control in a very small channel of 20 x 20 µm (W x H), half of which could be coated with only one aptamer/concentration.
Thus, the aim of the project was to scale up and semi-automate the system, to precisely immobilize different antibodies or antibody concentrations within one channel, and to reproduce cell slowing with different cell lines and translation to the use of patient samples. First, treatment with oxygen plasma followed by functionalization of polymethyl methacrylate (PMMA) with neutravidin via carbodiimide chemistry created a stable functionalization with high protein binding capacity. By applying a microarray spotter and dissolving the antibodies in polyvinyl alcohol buffer (PVA), we achieved precise immobilization of the antibodies within the channel, which induced specific attachment of cells to the coated areas. At the same time, the coating remains adaptable to changing chip/channel geometries. The affinity-based specific adhesion of cells to the antibody-coated areas was confirmed by comparing gene expression patterns by quantitative real-time polymerase chain reaction (qrt-PCR) and immunofluorescence. Fairly low recovery rates for all cell experiments in the chip were due to chip geometry, which could be avoided by a dedicated chip. Among other things, technical difficulties with the detection system are also responsible for the fact that cell rolling could not be reproduced. Improvement of the software, use of other antibodies and cell lines as well as a possible mixing of the antibodies with selectins, could be starting points for a solution in future experiments.