Applications for liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry and evaluation of the oxidation processes towards compound specific δ15N analysis

LC-IRMS has become a valuable tool in analytical chemistry since it was established in 2004. With more than 70 published applications in peer reviewed journals in the past 15 years, the main fields of application are in authenticity control, degradation of environmental contaminants, and the measurement amino acid in the context of nutrition, archeology, or forensics. As demonstrated in the present work by the elucidation of the plant origin of xylitol in chewing gums, compound specific δ13C analysis by LC-IRMS is able to deliver precise carbon isotopic information with a simple sample preparation procedure and an online combination of analyte separation and measurement. With the developed method and sample preparation, xylitol in chewing gum formulations based on wood material could be discriminated from the cheaper substituent which is based on corn husks. Many applications using δ13C analysis could benefit from an additional determination of the δ15N information, which can increase the power to discriminate between analyte sources or serve as an additional information in the monitoring of the degradation of pollutants.
To develop a LC-IRMS system based on the persulfate oxidation process in combination with a membrane gas separation unit for δ15N measurements, the oxidation process in the interface under standard δ13C measurement conditions was thoroughly evaluated. Special focus of the work on the oxidation efficiency was on the interaction of the interface oxidation parameters, as these are commonly not evaluated in existing publications. The obtained results show that accurate isotopic signatures for carbon can be obtained even though the transformation to CO2 is not 100 % complete if the principle of identical treatment of the analytes and reference substances is applied. In addition, the common assumption that a linear correlation between analyte concentration and signal intensity in LC-IMRS indicates complete conversion of the analyte could be disproved. Only with the developed combination of TOC measurement and the LC-IRMS interface or separate referencing with a carbonate standard, exact information about the oxidation efficiency in the interface can be obtained. Based on the standard oxidation conditions in the interface, batch experiments with nitrogen containing model analytes were performed in a large scale reaction vessel to obtain a time resolved speciation of the nitrogen containing reaction products formed during the mineralization. For the analysis of the remaining organic analyte, the total bound nitrogen, ammonium, nitrate, and nitrite, analytical methods were developed on a combined TOC/TNb instrument and two IC systems for anion and cation chromatography. The main challenge for the method development were the high background of sodium or potassium as well as sulfate and persulfate that originates from the oxidation agent which is present in large excess (g L-1 for the oxidation agent vs. low mg L-1 for the nitrogen containing mineralization products). The TNb measurement was strongly affected by the presence of persulfate especially for ammonium and organic nitrogen, whereas nitrate was not affected at the tested conditions. Based on the TOC and the ion chromatography based measurements, nitrate and ammonium could be identified as the main products of the mineralization. The results were evaluated with a nitrogen mass balance approach which indicated, that for the tested model compounds, overall nitrogen recoveries between 91 and 102 % could be obtained. Under the standard oxidation conditions, ammonium oxidation to nitrate was not fast enough for the application in an online-reactor setup, which could be applied for the δ15N measurement by LC-IMRS.
As a result of the mixed production of ammonium and nitrate under acidic conditions the reaction conditions had to be adapted and oxidation of nitrogen containing analytes in an alkaline medium was evaluated. Initially, ammonium and nitrate were observed as the main reaction products, but the subsequent oxidation of ammonium to nitrate is comparably faster at alkaline conditions. The alkaline oxidation conditions were transferred from the batch reactor system to the LC-IMRS interface. At combined system flow rates of 275 μL min-1, more than 62.5 % of the initially introduced nitrogen could be recovered with a setup using a commercially available interface. For amino acids e.g. glycine, nitrate recovery rates of 85.5 % could be obtained. It could be shown, that increased residence times in the oxidation reactor (by reduction of the system flow) could lead to increased recoveries for the model compounds. Based on the evaluation of the persulfate oxidation reaction in the LC-IRMS interface and the results obtained for the oxidation under alkaline reaction conditions, nitrate could be utilized as an intermediate species used for quantitative conversion of the analyte nitrogen to an IRMS measureable gaseous form. The problem of the formation of two intermediate species (ammonium and nitrate) as observed for the oxidation under acidic conditions could be overcome by the new reaction conditions. The alkaline oxidation was successfully tested for model compounds in a commercially available LC-IRMS interface.

Die LC-IRMS Kopplung hat sich seit der Einführung des ersten kommerziell verfügbaren Systems im Jahr 2004 zu einer analytischen Methode mit breitem Anwendungsfeld entwickelt. Mehr als 70 Anwendungen wurden in den letzten 15 Jahren im Bereich der Authentizitätskontrolle, der Überwachung des Abbaus von Umweltschadstoffen und der Untersuchung von Aminosäuren im Kontext der Ernährungswissenschaften, der Archäologie, sowie der Forensik veröffentlicht. Wie in dieser Arbeit am Beispiel der Untersuchung der pflanzlichen Herkunft von Xylit aus Kaugummis gezeigt werden konnte, lassen sich mit Hilfe der LC-IMRS Technik präzise Kohlenstoffisotopenverhältnisse mit einer einfachen Probenvorbereitung und kombinierter Trennung und substanzspezifischer Detektion ermitteln. Mit der entwickelten Methode und Probenvorbereitung lässt sich zwischen dem in Kaugummis verwendeten Xylit welches aus Holz hergestellt wurde, und dem günstigeren Alternativprodukt aus Nebenerzeugnissen der Maisproduktion unterscheiden. Viele der zur Zeit genutzten Applikationen der δ13C Messungen könnten von einer zusätzlichen Bestimmung des Stickstoffisotopenverhältnisses profitieren, wodurch zum Beispiel die Unterscheidung zwischen der Quelle von Kontaminanten oder die Überwachung von Abbauprozessen der Analyten verbessert werden könnte.
Für die Weiterentwicklung des LC-IRMS Systems zur komponentenspezifischen δ15N Messung basierend auf der Oxidation der Analyten mit Persulfat in der flüssigen Phase und einer darauf folgenden Abtrennung der entstandenen Gase per Membran musste zunächst der Oxidationsprozess unter Standardbedingungen für die δ13C Messungen genau untersucht werden. Der Fokus der Arbeit zur Untersuchung der Oxidationseffizienz im Interface lag dabei auf der Interaktion der einzelnen Methodenparameter, da diese in der Literatur bisher nicht ausführlich untersucht wurde. Mit den Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass unter Berücksichtigung der identischen Handhabung von Analyten und Referenzmaterialien bei der Messung für Kohlenstoff akkurate Ergebnisse erzielt werden könne, auch wenn die oxidative Umsetzung im Interface nicht komplett ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die häufig getätigte Annahme, dass ein linearer Zusammenhang von Analytkonzentration und Intensität des Messsignals ein Indiz für eine vollständige Umsetzung im Interface sei wiederlegt werden. Mit der entwickelten Kombination von TOC Messungen und LC-IRMS Interface oder der separaten Referenzierung über einen Karbonatstandard lassen sich exakte Informationen über die Oxidationseffizienz im Interface erhalten. Um die Entstehung der stickstoffhaltigen Oxidationsprodukte währen der Mineralisierung stickstoffhaltiger organischer Verbindungen unter den standardmäßigen Oxidations-bedingungen im Interface zeitlich aufgelöst verfolgen zu können, wurde die Oxidation im größeren Maßstab in einem externen Reaktor durchgeführt. Zur Analyse des verbliebenen organischen Kohlenstoffs, des gesamt Stickstoff, Ammonium, Nitrat und Nitrit wurden analytische Methoden auf einem TOC/TNb Analysator und zwei IC Systemen zur Anionen- und Kationenchromatographie entwickelt. Ein Hauptaugenmerk bei der Methodenentwicklung lag auf dem großen Hintergrund an Natrium und Kalium sowie Sulfat und Persulfat aus dem Oxidationsmittel, der im großen Überschuss zu den Analyten in den Proben vorhanden ist (g L-1 an Oxidationsmittel im Gegensatz zu mg L-1 für die stickstoffhaltigen Oxidations-produkte). Die TNb Messungen wurden stark vom Überschuss an Oxidationsmittel beeinflusst, wobei es vor allem zu Unterbefunden bei Ammonium und organisch gebundenem Stickstoff kam, die Nitratmessung war unter den getesteten Bedingungen nicht beeinflusst. Mithilfe von TOC und IC Messungen konnten Nitrat und Ammonium als die Hauptreaktionsprodukte der Mineralisierung identifiziert werden. Die Ergebnisse wurden über eine Stickstoffmassenbilanz ausgewertet, die zeigen konnte, dass Wiederfindungsraten von 91 - 102 % für Stickstoff erreicht werden konnten. Unter den standardmäßigen Oxidationsbedingungen wurde das gebildete Ammonium nicht schnell genug in Nitrat umgesetzt um eine Realisierung der Oxidation in einem Durchflussreaktor zu ermöglichen, der für den Einsatz in einem Interface für die δ15N Analytik eingesetzt werden könnte.
Als Ergebnis der Bildung von Ammonium und Nitrat aus der Mineralisierung unter sauren Bedingungen wurden die Reaktionsbedingungen angepasst und Versuche zur Oxidation unter alkalischen Bedingungen durchgeführt. Auch hier wurden bei den Batch-Versuchen zunächst Ammonium und Nitrat als Hauptprodukte identifiziert, allerdings konnte gezeigt werden, dass die Oxidation von Ammonium zu Nitrat unter alkalischen Bedingungen deutlich schneller abläuft. Die Oxidationsbedingungen aus den Reaktorversuchen wurden auf die Oxidation im Durchflusssystem des LC-IRMS Interfaces übertragen. Bei Gesamtflüssen von 275 μL min-1, konnten mehr als 62.5 % des vorhandenen Stickstoffes aus den Analyten zu Nitrat umgewandelt werden. Für Aminosäuren wie z.B. Glycin, konnten sogar Umsatzraten von bis zu 85.5 % erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass für eine Verbesserung der Oxidationseffizienz vor allem eine Erhöhung der Aufenthaltszeit im Reaktor (über einen niedrigeren Fluss) ausschlaggebend ist.Auf der Grundlage der Erkenntnisse aus der Untersuchung der Oxidationseffizienz im LC-IRMS Interface und den Ergebnissen der Versuche zur alkalischen Oxidation, hat sich gezeigt, dass Nitrat als Zwischenstufe für die möglichst quantitative Umsetzung des im Analyten gebundenen Stickstoffes zu einem mittels IRMS messbaren Gas sehr gut geeignet ist. Die Problematik der parallelen Bildung von Ammonium und Nitrat unter sauren pH Bedingungen kann so unter den neu entwickelten Reaktionsbedingungen vermieden werden. Die Oxidation unter alkalischem pH konnten in einem kommerziell verfügbaren LC-IMRS System mit verschiedenen Modellsubstanzen erfolgreich getestet werden

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