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Biochemical and Structural reconstitution of the outer Kinetochore of Drosophila melanogaster

Liu, Yahui

Eine genaue Chromosomensegregation während der Mitose und der Meiose ist entscheidend für die zelluläre und organisatorische Lebensfähigkeit. Kinetochore verbinden Chromosomen mit Spindel-Mikrotubuli und sind für die Chromosomensegregation essentiell. Diese großen Proteingerüste entstehen aus dem Zentromer, einer spezialisierten Region des Chromosoms, angereichert mit der Histon-H3-Variante CENP-A. In den meisten Eukaryoten besteht der Kinetochore-Kern aus dem Zentromer-proximalen konstitutiven Zentromer-assoziierten Netzwerk (CCAN), das CENP-A bindet und 16 Untereinheiten enthält, und des Zentromer-distalen Knl1/Zwint, Mis12C, Ndc80-Komplexnetzwerk (KMN). Das KMN-Komplexnetzwerk bindet Mikrotubuli und setzt sich aus 10 Untereinheiten zusammen. In der Fruchtfliege Drosophila melanogaster erlebte die Kinetochore bemerkenswerte Vereinfachungen. Alle CCAN-Untereinheiten, mit Ausnahme von Zentromer-Protein C (CENP-C) und zwei KMN-Untereinheiten, Dsn1 und Zwint, können in diesem Organismus nicht identifiziert werden. Zusätzlich sind zwei paralogs der KMN-Untereinheit Nnf1 (Nnf1a und Nnf1b) vorhanden. Schließlich erlebte die Spc105R-Untereinheit, homolog zu humanem Knl1/CASC5, im Vergleich zu anderen Organismen erhebliche Sequenzänderungen. Wir kombinierten die biochemische Rekonstitution mit biophysikalischen und strukturellen Methoden, um zu untersuchen, wie sich diese Veränderungen auf die Organisation des Drosophila KMN Netzwerks auswirken. Wir zeigen, dass die Nnf1a- und Nnf1b-Paralogs Untereinheiten unterschiedlicher Komplexe sind, die beide direkt mit Spc105 und mit CENP-C wechselwirken, wobei letztere eine Bindungsstelle an der Mis12-Untereinheit identifizieren. Unsere Studien beleuchten die strukturelle und funktionelle Organisation eines stark divergierenden Kinetochore-Teilchens.

Dividing cells go through a series of events, named the cell cycle, to generate two new cells that are genetically equal. Faithful sister chromatid separation to the arising daughter cells is a crucial step in the cell cycle. To achieve that, kinetochores, multi-protein complexes that assemble on centromeric chromatin, act as a bridge between microtubules and chromatids. In human and yeast, kinetochores consist of two major parts: the constitutive centromere-associated network (CCAN, the inner kinetochore) and the Knl1 complex, Mis12 complex, Ndc80 complex (KMN) network. The CCAN contains 16 subunits and links the kinetochore to CENP-A. The KMN network contains 10 subunits and is responsible for the binding of microtubules and the recruitment of spindle assembly checkpoint (SAC) components. The popular model organisms Drosophila melanogaster and related organisms have a significantly simplified kinetochore: they lost all CCAN components with the exception of CENP-C and lost two outer kinetochore subunits (one Mis12 complex (Mis12C) subunit and one Knl1 complex subunit, Zwint). In addition, there are two homologues of the Mis12C subunit Nnf1 (Nnf1a and Nnf1b). The simplified Drosophila kinetochore thus forms an ideal model to study conserved structural and functional properties of kinetochores. During my doctoral work, I studied the Drosophila KMN network using an in vitro biochemical reconstitution approach. My reconstitution experiments indicate that there are two distinct three-subunit Mis12 complexes in Drosophila, DmMis12a and DmMis12b complexes. Despite the absent subunit, negative stain electron microscopy shows that the DmMis12C has an extended polarized structures, comparable to its human and yeast counterparts. Biochemical studies combined with cross-linking-mass spectrometry (XL-MS) proved that Mis12 and Nnf1 form the backbone of Mis12C in both DmMis12a and DmMis12b. Using deletion experiments, I proved that both the C-terminal of Knl1 and the N-terminal of CENP-C bind to DmMis12C. Furthermore, I identified the motifs responsible for the binding between CENP-C and Mis12C in Drosophila: the conserved 3 phenylalanine residues at the N-terminal of Mis12 (F12, F13 and F15) and the 27 amino acids at the N-terminal end of CENP-C (residues 9 to 35). In cooperation with Dr. Arsen Petrovic and Dr. Jenny Keller, we solved the high-resolution structure of the tetrameric human Mis12C in complex with the N-terminal segment of CENP-C. We provided a model for how Aurora B controls Mis12C assembling to kinetochore. We demonstrated that the Dsn1 subunit is an important substrate of Aurora B in the human Mis12C. Together with a structure-based in silico analysis, this led us to hypothesize that the lost subunit in Drosophila Mis12 complex could be Nsl1, and not Dsn1 as previously suggested. In summary, my studies provided new insights on the structural and functional properties of outer kinetochores in humans and Drosophila.

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Liu, Yahui: Biochemical and Structural reconstitution of the outer Kinetochore of Drosophila melanogaster. 2017.

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