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Funktionale Analyse von Parvulin Protein Par14

Eremeev, Andrey A.

In der vorliegenden Arbeit sollten die Voraussetzungen für einen doppelten Knockout von Pin1 und Par14 innerhalb des DT40-Zellsystems geschaffen werden.
Zunächst wurde das Zielkonstrukt für den Par14-Locus in einer mehrstufigen Klonierung generiert. Dies schloss 7 kb der genomischen Par14-Sequenz ein sowie eine LoxPErkennungssequenz innerhalb von Intron 1-2 sowie eine zweite LoxP-Stelle und einem Neomycin-Selektionsmarker innerhalb der 3‘-Sequenz. Mit diesem Konstrukt wurden DT40-MerCreMer-Zellen transfiziert und auf Insertion des Konstrukts selektiert. Der erfolgreiche Austausch des ersten Alles wurde mittels Southern Blot nachgewiesen, der hierfür im Labor erstmalig etabliert wurde. Der Austausch des zweiten Allels war auch nach mehrmaligenWiederholungen nicht erfolgreich.
Das DT40-System mit stabil integrierter Cre-Rekombinase ermöglicht neben einem induzierbaren Knockout, das Ausschalten eines anderen Proteins (Doppel-Knockout). In der vorliegenden Arbeit konnte die genomische Sequenz des Pin1-Locus zwischen dem ersten und vierten Exon von Gallus gallus amplifiziert und sequenziert werden. Dies war nur nach methodischen Verbesserungen beim Amplifizieren und Klonieren von extrem GC-reichen Nukleotidsequenzen möglich. Somit liefert diese Arbeit die Voraussetzung für einen späteren Knockout des Pin1-Locus von Gallus gallus. Im Laufe der Arbeiten für den genetischen Knockout von Par14 in DT40-Zellen zeigte eine Studie von einer Arbeitsgruppe aus Japan eine Möglichkeit, die Expression von Par14 mittels der Knockdown-Methode zu reduzieren (Fujiyama-Nakamura et al., 2009). In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression von Par14/17 mittels RNA-Interferenz durch die Verwendung von Stealth-siRNA-Konstrukten deutlich reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Knockdown von Parvulin durch eine starke Änderung im Phänotyp sowohl beim Wachstum als auch im Zellzyklus-Profil begleitet wird. Als DNA-bindendes Protein könnte Par14 auch einen Einfluss auf das Transkriptom haben. Dieser Einfluss wurde durch Microarray-Hybridisierung nach einem siRNA-Knockdown untersucht. Hier zeigte Par14 keinen Effekt, der offensichtlich vergleichbar war mit den Microarrays von bekannten Transkriptionsfaktoren. Die Daten der Microarray-Analyse liefern jedoch Informationen für zukünftige Studien zu einer möglichen kompensatorischen Funktion von anderen Genen (z. B. für ribosomale Biogenese) bei Par14-Verlust.

In the present work the conditions for a double knockout of Pin1 and Par14 within the DT40 cell line should be established.
First the target construct for the Par14-locus was cloned in a multistep procedure. This encloses the 7 kb genomic sequence of Par14 as well as a LoxP-recognition sequence within Intron 1-2, the second LoxP place and a Neomycin-selection marker within 3' sequences. With this construct DT40-MerCreMer cells ware transfected and selected on insertion of the construct. The successful exchange of the first allele was confirmed by Southern Blot which was set up for this in the lab first. The exchange of the second allele was not successful.
The DT40 system with stable expression of the Cre-Rekombinase allows both an inducible knockout and switching off another protein (double knockout). In the present work the genomic sequence of Pin1 locus between the first and the fourth exon of Gallus gallus was amplified and sequenced. This was possible only after methodical improvements of the amplification and cloning of the extreme GC rich nucleotide sequences. Therefore this work gives the possibility for a later knockout of the Pin1 locus of Gallus gallus.
During this work for the genetic knockout of Par14 in DT40 cells a study of a working group from Japan showed, that it is possible to reduce the expression of Par14 by means of the knockdown method (Fujiyama-Nakamura et al., 2009). In the present work the expression of Par14 was clearly reduced by means of RNA interference technology with the stealth siRNA constructs. It could be shown that the knockdown of parvulin is associated with a strong change of the phenotype by the cell growth as well as the cell cycle profile. As a DNA-binding protein Par14 could also have an effect on the transkriptom. This effect was examined by microarray hybridisation. Here Par14 showed no effect which was obviously comparable with the microarrays of known transcription factors. Nevertheless, the data of the Microarray analysis deliver information for future studies to a possible compensatory function of other genes (e. g., for ribosomale biogenesis) by loss of Par14.

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Eremeev, Andrey A.: Funktionale Analyse von Parvulin Protein Par14. 2011.

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