Oberflächenmodifizierung von Calciumphosphat-Nanopartikeln mittels Klick-Chemie

 

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Vielfältigkeit der Klick-Chemie anhand unterschiedlicher Oberflächenmodifizierungen an CaP-NPs zu verdeutlichen. Auf diesem Weg sollte ein variables Wirkstoffträgersystem geschaffen werden, um einen weitgefächerten Einsatz in medizinischen und biologischen Anwendungen zu schaffen. Ein weiterer Vorteil der Klick-Chemie ist, dass mit ihr eine Kopplung unter milden Temperaturen stattfinden und mit ihr in Wasser als Lösemittel gearbeitet werden kann. Durch die Varianz der Oberflächenbeladung der CaP-NPs mittels positiv und negativ geladener Polymere, konnte die Effektivität der Klick-Reaktion untersucht werden. Hierfür wurden die CaP-NPs nach der Stabilisierung mittels PEI oder CMC mit Azidgruppen funktionalisiert und mit Alkingruppen-terminierten Liganden geklickt. Dabei hat sich gezeigt, dass das Anklicken nicht nur von Molekülen, sondern auch mittels ultrakleiner Gold-NPs erfolgreich war.

Die Arbeit kann somit in vier Gruppen unterteilt werden in denen verschiedene fluoreszenzmarkierte Biomoleküle sowie Gold-NPs an die CaP-NPs geklickt wurden.

Als Biomoleküle wurden fluoreszenzmarkiertes 1) Env, 2) Hämoglobin sowie 3) BSA mit gleichzeitiger Farbstoff-Zugabe zur Klick-Reaktion gegeben. Zur letzten Gruppe wurden 4) fluoreszenzmarkierte Au-NPs eingesetzt.

Bei der Erforschung eines geeigneten HIV-Impfstoffes wurden drei verschiedene Partikelarten synthetisiert, um eine zusätzliche Immunantwort von unterschiedlichen Zelltypen hervorzurufen. Dabei wurden neben der Synthese von CaP-NPs mit Peptiden, Adjuvanten im Inneren und spezifischen Antikörpern auf der Oberfläche (T-CaPs), Env-Moleküle spezifisch (Klick-Chemie, CaP/PEI/SiO2-N3) und unspezifisch (Sulfo-SMCC, CaP/PEI/SiO2-SH) an die CaP-Nanopartikeloberfläche gebunden (B-CaPs). Anschließend wurden VLP’s des HP-Virus mit einer CaP- und Silica-Schale ummantelt und im nächsten Schritt mittels Klick-Chemie mit dem fluoreszierenden Hüll-Glycoprotein Env geklickt (Viro-CaPs). Es hat sich durchgehend gezeigt, dass der hydrodynamische Durchmesser anhand der Anzahlverteilung nach der Klick-Reaktion größer gewesen ist als vor der Reaktion mit den entsprechenden Env-Molekülen. Diese Größenzunahme und die Zunahme des PDI weist auf ein erfolgreiches Anklicken hin. Das polydisperse System, welches mit dem PDI größer 0,3 angezeigt wurde, konnte auch an den STEM-Aufnahmen bestätigt werden, in welchen ein gewisser Agglomerationsgrad der NPs beobachtet werden konnte. Für die Ermittlung der Größenverteilung des anorganischen Durchmessers der CaP-NPs wurden 50 Partikel vermessen. Diese Vermessungen spiegelten eine heterogene Größenverteilung wider. Dennoch konnte durch die Messungen des Zeta-Potentials (˃ ±12 mV) und die monomodale Größenverteilungen in den DLS-Messungen auf stabile NPs geschlossen werden. Mittels EDX-Mappings konnte die erfolgreiche Beschichtung der VL-Partikel bestätigt werden. Durch die UV-Vis-Messungen konnte neben der Farbstoff-Konzentration (AF647à λ = 647 nm und AF488 à λ = 488 nm) auch die Konzentration an Protein (λ = 280 nm) gemessen und für die Berechnungen der Env-Anzahl pro CaP-NPs eingesetzt werden. Anhand von CLSM-Aufnahmen konnten die beschichteten VLP’s mit geklickten Env-Molekülen im intrazellulären Raum bestätigt werden. Dies wäre ein großer Vorteil für die Entwicklung einer neuen Impfstoffplattform gegen den HI-Virus.

Bei der Modifizierung der CaP-Nanopartikeloberfläche mit fluoreszierenden Hämoglobin-Molekülen hat sich gezeigt, dass die Ladung der vorherigen Polymerstabilisierung ausschlaggebend für die Beladung ist. Aus den zusammenfassenden Tabellen in den Kapiteln konnte gezeigt werden, dass eine positive Ladung der CaP-NPs die Klick-Reaktion der Hämoglobin-Moleküle begünstigt. Dies konnte an spektroskopischen Vermessungen bestätigt werden, bei welchen die Anzahl des AF647-Farbstoff-Moleküls durchschnittlich zwischen 3,2 (PEI-stabilisiert) und 3,0 (CMC-stabilisiert) bei einem Hämoglobin-Molekül liegt.

Mit Hilfe der UV-Vis-Auftragung konnte eine Konkurrenzreaktion zwischen den größeren BSA-AF647-Molekülen und kleineren AF488-Farbstoff-Molekülen beobachtet werden, denn trotz der gleichbleibenden Zugabe der BSA-Moleküle, aber steigender Farbstoffkonzentration, konnte mehr AF488-Farbstoff detektiert werden. Gleiche Beobachtungen konnten auch hier, wie bei dem Klicken der Hämoglobin-Moleküle bei einer negativ geladenen CaP-Nanopartikeloberfläche gemacht werden. Bei einer PEI-Stabilisierung konnten im Schnitt 42-Mal so viele BSA-Moleküle angebracht werden als bei den CMC-stabilisierten. Dies kann vor allem mit dem Isoelektrischen Punkt von BSA (ca. 4,5)[210] erklärt werden, an welchem es somit zu einer Abstoßung der CaP-Oberfläche und dem Molekül kommt. 

Die Beladung der ultrakleinen Gold-NPs mit AF647-Farbstoff-Molekülen betrug zwischen 2,2 und 2,4. Sokolova et al. publizierten in ihrer Arbeit, dass unter der herkömmlichen Funktionalisierungsreaktion bis zu 18 AF647-Moleküle auf der Gold-Nanopartikeloberfläche angebunden werden können.[211] In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch nur ein Drittel der Konzentration des AF647-Farbstoffes zum Anklicken an die Gold-NPs angewendet, um nicht alle funktionellen Gruppen zu besetzen. Ein weiterer Unterschied ist auch, dass die resultierenden Au-AF647-NPs zur weiteren Reaktion mit den CaP-NPs eingesetzt wurden.

Eine weitere Bestätigung der erfolgreichen Anbindung der unterschiedlichen fluoreszierenden Moleküle bzw. Gold-NPs war die Fluoreszenzspektroskopie sowie die Fluoreszenzmikroskopie. Wie anfangs erwähnt, dienten die verschieden funktionalisierten CaP-NPs als Wirkstoffträger für die Moleküle auf deren Oberfläche, in den Zellen. Nach einer Inkubationszeit von 24 h und mehreren Waschschritten vor der Mikroskopie, konnte die Fluoreszenz der markierten Moleküle im Zytosol aufgenommen werden. Mittels CLSM-Untersuchungen und z-Schnitten konnten anschließend die CaP-NPs-Systeme in den HeLa-Zellen lokalisiert werden. So wurde bestätigt, dass sich die fluoreszierenden Molekül-beladenen CaP-NPs nicht auf der Zellmembran, sondern intrazellulär anzutreffen sind. Anhand der Zelluntersuchungen konnte zusätzlich die Stabilität der funktionalisierten CaP-Nanopartikelsysteme in in vitro-Untersuchungen bewiesen werden, da die Moleküle auf der Oberfläche der CaP-NPs geklickt waren und somit in die Zellen aufgenommen wurden. In der Literatur wird berichtet, dass Moleküle ohne die CaP-NPs als Wirkstoffträger nicht von Zellen aufgenommen werden und somit auch keine Fluoreszenz im intrazellulären Raum beobachtet werden kann.[212] Trotz leichter Agglomerationen an der Zellmembran konnte der Großteil der CaP-NPs im Zytosol detektiert werden. Mittels zusätzlicher MTT-Analysen konnte bewiesen werden, dass die unterschiedlich funktionalisierten CaP-NPs nicht toxisch sind und eine hohe Zellviabilität nach 24 h Inkubation (85 - 91%) bestätigt werden konnte. Unter anderem hat sich auch gezeigt, dass die PEI-stabilisierten CaP-NPs eine höhere Zellviabilität aufweisen, als die CMC-stabilisierten. Dies kann aus der moderaten Zytotoxizität der stabilisierenden Polymere resultieren.[213]Aus den MTT-Tests lässt sich ebenfalls erkennen, dass die unterschiedliche Beladung mit Molekülen bzw. Gold-NPs auf den CaP-NPs keinen Einfluss auf die Zellviabilität ausübt.

 

 

The aim of the present work was to illustrate the versatility of click chemistry using different surface modifications on CaP-NPs. In this way, a variable drug carrier system should be created in order to create a wide range of uses in medical and biological applications. Another advantage of click chemistry is that a coupling can take place under mild temperatures and in water as solvent. By varying the surface loading of the CaP-NPs using positively and negatively charged polymers, the efficacy of the click reaction could be studied. For this purpose, the CaP-NPs were functionalized with azide groups after stabilization with PEI or CMC and clicked with alkyne group-terminated ligands. It was shown that the clicking was successful not only of molecules but also of ultrasmall gold-NPs.

The work can be divided into four groups in which different fluorescently labelled biomolecules as well as gold-NPs were clicked onto the CaP-NP surface.

As biomolecules, fluorescently labelled 1) Env, 2) hemoglobin as well as 3) BSA with simultaneous dye addition were added to the click reaction. For the last group, 4) fluorescently labelled Au-NPs were used.

In research of a suitable HIV vaccine, three different types of particles were synthesized to elicit an additional immune response from different cell types of the immune system. In addition to synthesizing CaP-NPs with peptides, adjuvants inside and specific antibodies on the surface (T-CaPs), Env molecules were specifically (click chemistry, CaP/PEI/SiO2-N3) and non-specifically (Sulfo-SMCC, CaP/PEI/SiO2-SH) bound to the CaP nanoparticle surface (B-CaPs). Finally, VLP's of the HP-virus were coated with a CaP and silica shell and in the next step clicked with the fluorescent envelope protein Env using click chemistry (Viro-CaPs). It was consistently shown that the hydrodynamic diameter based on the number distribution was larger after the click reaction than before the reaction with the corresponding Env molecules. This increase in size and the increase in PDI indicates a successful clicking process. The polydisperse system indicated with the PDI greater than 0.3 could also be confirmed on the STEM images, where a certain degree of agglomeration of the NPs could be observed. For the determination of the size distribution of the inorganic diameter of the CaP-NPs, 50 particles were measured. These measurements reflected a heterogeneous size distribution. Nevertheless, the measurements of the zeta potential (˃ ±12 mV) and the monomodal size distributions in the DLS measurements led to the conclusion that the NPs were stable. By means of EDX mappings, the successful coating of the VLP particles could be confirmed. By UV-Vis-measurements, not only the dye concentration (AF647àλ = 647 nm and AF488àλ = 488 nm) but also the concentration of protein (λ = 280 nm) could be measured and used for the calculations of the Env number per CaP-NPs. Based on CLSM images, the coated VLP's could be confirmed with clicked Env-molecules in the intracellular space. This would be a great advantage for the development of a new vaccine platform against HIV.

When modifying the CaP-NP surface with fluorescent hemoglobin molecules, it has been shown that the charge of the previous polymer stabilization is crucial for the loading. Based on the summarized evaluation of the tables in the chapters, it could be shown that a positive charge of the CaP-NPs favors the click reaction of the hemoglobin molecules. This could be confirmed on spectroscopic measurements, where the number of AF647-dye-molecule is on average between 3.2 (PEI-stabilized) and 3.0 (CMC-stabilized) for one hemoglobin molecule.

Using UV-Vis-application, a competitive reaction between the larger BSA-AF647-molecules and smaller AF488-dye-molecules could be observed, as more AF488-dye could be detected despite the constant addition of the BSA-molecules but increasing dye concentration. The same observations could be made here as with the clicking of the hemoglobin-molecules with a negatively charged CaP nanoparticle surface. In the case of PEI stabilization, on average 42 times as many BSA-molecules could be attached as in the case of CMC-stabilized ones. This can be explained mainly by the isoelectric point of BSA (about 4.5),[210] where repulsion of the CaP surface and the molecules thus occurs. 

The loading of the ultrasmall gold NPs with AF647-dye-molecules was between 2.2 and 2.4. Sokolova et al. published in their work that under the conventional functionalization reaction up to 18 AF647-molecules can be attached on the gold nanoparticle surface.[211] In the present work however, only one-third of the concentration of AF647-dye was applied to click on the gold-NPs in order not to occupy all functional groups. Another difference is also that the resulting Au-AF647-NPs were used for further reaction with the CaP-NPs.

Further confirmation of the successful binding of the different fluorescent molecules or gold-NPs was provided by fluorescence spectroscopy as well as fluorescence microscopy. As mentioned at the beginning, the different functionalized CaP-NPs served as drug delivery systems for the molecules and NPs on their surface in the cells. After an incubation period of 24 h and several washing steps before microscopy, the fluorescence of the labelled molecules in cytosol could be recorded. By means of CLSM examinations and z-stacks, the CaP-NPs systems could then be localized in the HeLa cells. This confirmed that the fluorescent molecule-loaded CaP-NPs are not found on the cell membrane but intracellularly. Based on the cell investigations, the stability of the functionalized CaP-NP systems was additionally proven in in vitro-investigations that the molecules were clicked onto the surface of the CaP-NPs and were thus taken up into the cells. The literature reports that molecules alone, without the CaP-NPs as drug carriers, are not taken up by cells and thus no fluorescence can be observed in the intracellular space.[212] Despite slight agglomerations on the cell membrane, the majority of the CaP-NPs could be detected in the cytosol. By means of additional MTT analyses, it could be proven that the differently functionalized CaP-NPs are not toxic and a high cell viability after 24 h incubation (85 - 91%) could be confirmed. Among other things, it was also shown that the PEI-stabilized CaP-NPs have a higher cell viability than the CMC-stabilized ones. This may be due to the moderate cytotoxicity of the stabilizing polymers.[213] The MTT tests also show that the different loading of molecules or gold NPs on the CaP-NPs has no influence on cell viability.

Cite

Citation style:
Could not load citation form.

Rights

Use and reproduction:
All rights reserved