The Potential of LC-IRMS : Carbon stable isotope analysis of amino acids in a host-parasite system and a proof-of principle study for δ15N measurements of nitrat

Stable isotope analysis is an established technique and used in scientific branches like geology, meteorology, archaeology, food authenticity and ecology. Different instruments have been developed and although the measurement of stable isotope signatures by LCIRMS is not the most widely used method, it still bears major advantages over other more common instrumentations and is frequently used for δ13C analysis of carbohydrates, amino acids and compounds of environmental interest. This is demonstrated by compound specific isotope analysis of individual amino acids in a controlled feeding/infection experiment using a parasitic cestode (Schistocephalus solidus), its second intermediate host (three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus) and protein-rich fish diets to advance our understanding of trophic fractionation and nutrient transfer. The system was able to accurately measure the carbon stable isotope signature of thirteen individual amino acids with little sample preparation over an extensive sampling period. While trophic fractionation of amino acids in sticklebacks was low due to isotope routing on high protein diets, it was possible to see different trends in δ13C values over time in liver and muscle tissue, induced by a subtle carbon isotope shift of dietary sources between sampling days. Biosynthesis of non-essential amino acids in the liver was indicated from very small amounts of dietary lipids and highlight the strength of this technique combined with multivariate data analysis. A similar approach was used to show increased Δδ13CAA values of infected compared to uninfected sticklebacks on the same diet, indicating that the metabolic burden on host organisms induced by parasitic infection is reflected in the carbon isotope signature of amino acids through extensive catabolism, likely to fuel an ongoing immune response and to sustain parasitic growth. Compound specific isotope analysis has been highlighted as a powerful tool to study host-parasite interactions and precise measurements of carbon isotope signatures from small amounts of different sample materials enabled resource allocation in the parasite S. solidus, which pointed towards nutrients being assimilated from host liver tissue. The parasite accumulates large amounts of glycogen for maturation, and it was further possible to measure the carbon isotope signature of glucose from parasite tissues with little sample preparation and chromatographic separation. Biosynthesis of parasitic glucose from alanine, asparagine and glutamine was indicated by constant fractionation of -2 to -3 ‰ from enzymatic reactions, while possible conversion of threonine and serine to glycine for one-carbon metabolism and parasitic growth calls for further research using isotopically enriched materials to get more detailed information and quantify the nutrient transfer. To advance the field of LC-IRMS and show its potential for future applications, a modified interface for δ15N analysis of nitrate was developed and tested in a first proof-of-principle study. Reduction of nitrate to measurable N2 gas was facilitated with V(III)Cl3 and elemental copper using established techniques, while already reported improvements for the LC-IRMS interface were implemented to increase precision and lifetime of the ion source. The system was able to measure δ15N values from 10 µL injections of nitrate standards and reference materials with a concentration of 50 mgL-1Nand with a precision better than 1.4 ‰, while the linearity between δ15N values was sufficient for measurements on natural abundance levels. The biggest occurring problems were high nitrogen background signals from the mobile phase coupled with isotope shifts and nonlinear signal intensities from standards with different concentrations. However, it was already possible to apply this new technique to samples from an isotope enrichment experiment in a small river, where 15N-enriched ammonium chloride was administered over time to isotopically mark the surrounding environment through natural nitrification processes. In contrast to our expectations, no increase in the δ15N signature of nitrate was measured from downstream water samples during the first two weeks. However, the δ15N values of unknown nitrogen species eluting early during the injection peak were highly enriched in 15N. This could possibly be attributed to nitrite, although measurement errors due to the early stage of the interface cannot be completely disregarded. Further research and developments are overall necessary, but the system already shows promising results and could not only enable fast and reliable isotope analysis of nitrate for anthropogenic source allocation, but also increase the scope of LC-IRMS in the future by enabling δ15N analysis of organic compounds

Die stabile Isotopenanalyse ist eine etablierte Technik und wird häufig in wissenschaftlichen Bereichen wie der Geologie, Meteorologie, Archäologie, Lebensmittelechtheit und Ökologie benutzt. Unterschiedliche Instrumente wurden dazu entwickelt und obwohl die Messung von stabilen Isotopenverhältnissen mittels LC-IRMS nicht die am weitesten verbreitete Methode ist, so hat sie dennoch wesentliche Vorteile gegenüber anderen, verbreiteteren Instrumenten und wird häufig für die δ13C Analyse von Kohlenhydraten, Aminosäuren und umweltrelevanten Komponenten benutzt. Dies wird durch die komponentenspezifische Isotopenanalyse von individuellen Aminosäuren in einem kontrollierten Fütterungs- und Infektionsexperiment mit einer parasitären Zestode (Schistocephalus solidus), ihrem zweiten vorrübergehenden Wirt (drei-stachliger Stichling, Gasterosteus aculeatus) und proteinreicher Fischnahrung demonstriert, um unser Verständnis der trophischen Isotopenfraktionierung und dem Nährstofftransfer zu verbessern. Das System war in der Lage, die stabile Isotopensignatur von Kohlenstoff von insgesamt dreizehn Aminosäuren mit geringer Probenvorbereitung und über einen umfangreichen Probenzeitraum genau zu bestimmen. Obwohl die trophische Fraktionierung der Aminosäuren im Stichling aufgrund von Isotopenrouting bei Nahrung mit hohem Proteinanteil sehr gering ausfiel, war es möglich unterschiedliche zeitliche Trends in den δ13C-Werten in Leber- und Muskelgewebe zu sehen, welche durch geringe Unterschiede der Kohlenstoffisotopensignatur in der Fischnahrung induziert wurden. Die Biosynthese von nicht essenziellen Aminosäuren in der Leber wurde von sehr kleinen Mengen an Lipiden in der Nahrung angedeutet und hebt die Stärke dieser Technik in Kombination mit einer multivariaten Datenanalyse hervor. Ein ähnlicher Ansatz wurde genutzt, um höhere Δδ13C Werte von infizierten im Vergleich zu nicht infizierten Stichlingen auf derselben Diät zu zeigen, was auf eine höhere Belastung des Stoffwechsels von Wirten durch die Infektion mit Parasiten deutet und sich in der Kohlenstoffisotopensignatur der Aminosäuren durch umfangreichen Abbau widerspiegelt, womöglich um eine anhaltende Immunreaktion und das Wachstum des Parasiten zu gewährleisten. Die komponentenspezifische Isotopenanalyse wurde bereits als nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Wirt und Parasit hervorgehoben, und präzise Messungen der Kohlenstoffisotopensignaturen von geringen Mengen an Probenmaterialien ermöglichten es, die Nährstoffquelle des Parasiten S. solidus innerhalb des Wirtes zu bestimmen. Diese deutete auf die Assimilation von Ressourcen aus dem Lebergewebe des Wirtes oder deren Metabolite hin, und der Parasit ist folglich in der Lage große Mengen an Glykogen anzureichern, welches er für das Heranwachsen benötigt. Die Kohlenstoffisotopensignatur der Glukose konnte zusätzlich mit einer einfachen Probenvorbereitung und chromatografischen Trennung gemessen werden. Glukose im Parasiten könnte in großen Mengen durch Biosynthese aus Alanin, Asparagin und Glutamin produziert werden, da die Kohlenstoffisotopensignatur der Glukose zu diesen Aminosäuren über die Zeit sehr konstant zu -2 bis -3 ‰ niedriger war, was der Idee von enzymatischen Reaktionen entspricht, die häufig gegenüber den schwereren Isotopen diskriminieren. Zusätzlich wurde eine mögliche Umwandlung von Threonin and Serin zu Glycin durch Isotopenfraktionierung sichtbar, was insgesamt zu weiteren Studien mit isotopisch angereicherten Materialien anregt, um mehr detaillierte Informationen zu erhalten und eine Quantifizierung des Nährstofftransfers zwischen Wirt and Parasit zu ermöglichen. Um das Feld der LC-IRMS zu erweitern, wurde ein modifiziertes Interface zur Analyse von δ15N Werten aus Nitrat entwickelt und in einer ersten Proof-of-Principle Studie getestet. Die Reduzierung von Nitrat zu messbarem N2 wurde mit V(III)Cl3 und elementarem Kupfer anhand etablierter Techniken verwirklicht, wobei bereits veröffentlichte Verbesserungen für die LC-IRMS zusätzlich implementiert wurden, um die Präzision und Langlebigkeit der Ionenquelle zu erhöhen. Es war möglich die δ15N Werte aus 10 µL Injektionen von 50 mgL-1 N Nitratstandards und Referenzmaterialien mit einer Präzision besser als 1.4 ‰ zu bestimmen, wobei die Linearität zwischen den δ15N Werten ausreichend gegeben war, um Messungen mit natürlichen Isotopenverhältnissen zu ermöglichen. Die größten auftretenden Probleme waren hohe Hintergrundwerte an Stickstoff aus der mobilen Phase und nicht-lineare Signalstärken von Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nitrat. Trotzdem war es bereits möglich diese neue Technik auf Proben von einem Anreicherungsexperiment anzuwenden, wo 15Nangereichertes Ammoniumchlorid in einen Fluss eingebracht wurde, um die Umgebung durch natürliche Nitrifizierungsprozesse isotopisch zu markieren. Entgegen unserer Erwartung konnte allerdings innerhalb der ersten zwei Wochen kein Anstieg der δ15N Werte von Nitrat in Wasserproben flussabwärts gemessen werden. Zugleich waren die δ15N Werte von unbekannten Stickstoffspezies, die früh im Chromatogramm mit dem Injektionspeak eluierten, stark an 15N angereichert. Dies könnte möglicherweise auf angereichtes Nitrit zurückzuführen sein, wobei Messfehler aufgrund des frühen Entwicklungsstadiums des Interfaces nicht ausschließbar sind. Weitere Experimente und Entwicklungen sind demnach notwendig, wobei das System schon jetzt vielversprechende Ergebnisse liefert und eine schnelle und zuverlässige Isotopenanalyse von Nitrat zur Bestimmung von anthropogenen Quellen ermöglichen kann. Zusätzlich sind weitere Anwendungsmöglichkeiten wie die δ15N Analyse von organischen Substanzen in Zukunft denkbar, was den Anwendungsbereich der LC-IRMS stark erweitern würde.

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