Functional role of small extracellular vesicles associated DNA and chromatin in pediatric acute myeloid leukemia (AML)
Acute myeloid leukemia (AML) is the second most common pediatric leukemia, with relapse in >30% of the patients. Although pediatric AML patients' survival rate has been significantly improved in the last years using innovative and advanced therapeutic strategies, it remains unclear how AML cells evade chemotherapy resulting in relapse. In AML, it is known that there is a crosstalk between AML blasts and critical components in the bone marrow microenvironment (BMM), resulting in abnormal proliferation and differentiation blockage of stem cells, which disrupts the normal hematopoiesis in favor of leukemogenesis. Besides chromosomal abnormalities and clonal disorders, recent studies demonstrated that proteins and RNA cargoes associated with small extracellular vesicles (sEVs) released by AML blasts execute the molecular changes in the BMM and transform it into AML permissive microenvironment. Nevertheless, sEVs also contain other biomolecular cargoes, including DNA. Therefore, the current study aimed to evaluate the functional role of DNA and DNA-protein complex (chromatin) associated with sEVs in pediatric AML.
sEVs are membrane-enclosed nanovesicles (30-200 nm) released by both healthy and tumor cells into the extracellular space. Detailed functional studies of DNA associated with sEVs (EV-DNA) were set back due to the lack of an sEV isolation method that efficiently separates sEVs from cell-free DNA (cfDNA) and apoptotic bodies. In this regard, using controlled culture conditions, we have established and optimized an efficient sEV isolation method suitable for EV-DNA functional studies by combining tangential flow filtration, size-exclusion chromatography, and ultrafiltration, which we have termed “TSU”. Our results demonstrated that TSU provides sEV-enriched fractions F2 and F3 with only EV-DNA without cell-free DNA and apoptotic bodies. Interestingly, we found that EV-DNA derived from AML-sEVs interacts with healthy bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs), a predominant component of BMM that has a pivotal role in clonal hematopoiesis and leukemogenesis.
Next, three-dimensional (3D) confocal imaging analysis using Imaris software intriguingly revealed that most foreign EV-DNA is restricted at the recipient cell membrane barrier. At the same time, the remaining EV-DNA overcomes this barrier and localizes in the cytoplasm and nucleus. In the cytoplasm, we found that EV-DNA interacts with cytoplasmic DNA sensors (cGAS/STING) and endosomal proteins that direct towards lysosomal degradation (Rab5/Rab7). At this point, this finding raises the question of whether EV-DNA is alone or bound with DNA-binding proteins.
Although many studies showed that histones are abundant in sEVs, they have not shown their direct association with EV-DNA. For the first time, using atomic force microscopy, cryo-electron microscopy, and 3D confocal imaging, we revealed that sEVs contain DNA and protein complexes resembling chromatin-like structures, which we termed EV-chromatin or Exogenotin. Mass spectrometry analysis of AML-derived EV-DNA-associated proteins showed that in addition to histones, desmosome proteins and S100 proteins were also abundant in EV-chromatin. Direct EV-DNA association or bound with histones is further confirmed by Western blot. Additionally, we revealed that healthy BM-MSCs treated with AML-sEVs downregulated p53 expression and its cell cycle (p21) and apoptosis-related proteins (BAX and PUMA). To further demonstrate whether the observed effect could be due to EV-DNA or EV-chromatin, engineered polymersomes were utilized for the EV-DNA or EV-chromatin packaging. Surprisingly, we found that EV-chromatin, but not EV-DNA, regulates the proliferation of the BM-MSC cells by suppressing the p53-mediated transcription of p21. On the other hand, EV-chromatin apparently upregulated canonical p53 inhibitor (MDM2) in BM-MSCs. Nevertheless, inhibition of MDM2 either by using inhibitor Siremadlin or by siRNA restored p53 activity in BM-MSCs. Altogether, our results indicate that AML-derived EV-chromatin causes p53 dysfunction in healthy BM-MSCs through MDM2. In the future, revealing the role of additional proteins like S100 associated with EV-chromatin in BMM would enable the development of promising therapeutics to treat pediatric AML patients.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist die zweithäufigste pädiatrische Leukämie, die bei mehr als 30 % der Patienten zu einem Rückfall führt. Obwohl die Überlebensrate pädiatrischer AML-Patienten in den letzten Jahren durch innovative und fortschrittliche Therapiestrategien erheblich verbessert werden konnte, ist nach wie vor unklar, wie AML-Zellen der Chemotherapie entgehen können, was zu einem Rückfall führen kann. Es ist bekannt, dass es bei der AML eine Wechselwirkung zwischen AML-Blasten und kritischen Komponenten in der Mikroumgebung des Knochenmarks (BMM) gibt, die zu einer abnormalen Proliferation und einer Differenzierungsblockade der Stammzellen führt, wodurch die normale Hämatopoese zugunsten der Leukämogenese gestört wird. Neben Chromosomenanomalien und klonalen Aberrationen haben jüngste Studien gezeigt, dass kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die mit Proteinen und RNA beladen sind, und die von AML-Blasten freigesetzt werden, diese molekularen Veränderungen im BMM bewirken und es in eine permissive Mikroumgebung für AML verwandeln. Allerdings enthalten sEVs auch andere biomolekulare Strukturen, einschließlich DNA. Ziel der aktuellen Studie war es daher, die funktionelle Rolle der DNA und des DNA-Protein-Komplexes (Chromatin) in Verbindung mit sEVs bei pädiatrischer AML zu untersuchen.
sEVs sind membranumschlossene Nanovesikel (30-200 nm), die sowohl von gesunden Zellen als auch von Tumorzellen in den extrazellulären Raum abgegeben werden. Detaillierte funktionelle Studien mit sEVs assoziierter DNA (EV-DNA) wurden durch das Fehlen einer sEV-Isolierungsmethode, die sEVs effizient von zellfreier DNA (cfDNA) und apoptotischen Vesikeln trennt, zurückgeworfen. In diesem Zusammenhang haben wir unter kontrollierten Kulturbedingungen eine effiziente sEV-Isolierungsmethode etabliert und optimiert, die sich für funktionelle EV-DNA-Studien eignet, indem wir Tangentialflussfiltration, Größenausschlusschromatographie und Ultrafiltration miteinander kombinieren, was wir als "TSU" bezeichnet haben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass TSU sEV-angereicherte Fraktionen F2 und F3 mit ausschließlich EV-DNA ohne zellfreie DNA und apoptotische Vesikel liefern. Interessanterweise fanden wir heraus, dass EV-DNA aus AML-sEVs mit aus dem Knochenmark stammenden gesunde mesenchymalen Stromazellen (BM-MSCs) kommuniziert, die eine vorherrschende Komponente des BMM darstellt und eine zentrale Rolle bei der klonalen Hämatopoese und Leukämogenese spielt.
Eine dreidimensionale (3D) konfokale Bildgebungsanalyse mit der Imaris-Software ergab, dass der größte Teil der fremden EV-DNA auf die Membranbarriere der Empfängerzellen beschränkt ist. Trotzdem überwindet die verbleibende EV-DNA diese Barriere und lokalisiert sich im Zytoplasma und im Zellkern. Im Zytoplasma fanden wir heraus, dass EV-DNA mit zytoplasmatischen DNA-Sensoren (cGAS/STING) und endosomalen Proteinen interagiert, die zum lysosomalen Abbau führen (Rab5/Rab7). Diese Erkenntnis wirft die Frage auf, ob EV-DNA allein oder in Verbindung mit DNA-bindenden Proteinen vorliegt.
Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass Histone in sEVs reichlich vorhanden sind, konnten sie keine direkte Verbindung mit der EV-DNA zeigen. Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie, der Kryo-Elektronenmikroskopie und der konfokalen 3D-Bildgebung konnten wir erstmals zeigen, dass sEVs DNA- und Proteinkomplexe enthalten, die chromatinähnliche Strukturen aufweisen, die wir als EV-Chromatin oder Exogenotin bezeichnet haben. Die massenspektrometrische Analyse von EV-DNA-assoziierten Proteinen zeigte, dass neben Histonen auch Desmosomenproteine und S100-Proteine reichlich im EV-Chromatin vorhanden waren. Die direkte Assoziation von EV-DNA mit Histonen oder deren Bindung an Histone wurde durch Western Blot weiter bestätigt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass mit AML-sEVs behandelte BM-MSCs die Expression von p53 und dessen Zellzyklus- (p21) und Apoptose-bezogenen Proteinen (BAX und PUMA) herunterregulieren. Um weiter zu zeigen, ob der beobachtete Effekt auf EV-DNA oder EV-Chromatin zurückzuführen ist, wurden für die Verpackung der EV-DNA oder des EV-Chromatins konstruierte Polymersomen verwendet. Überraschenderweise stellten wir fest, dass EV-Chromatin, nicht aber EV-DNA, die Proliferation der BM-MSC-Zellen durch Unterdrückung der p53-vermittelten Transkription von p21 reguliert. Andererseits hat EV-Chromatin offenbar den kanonischen p53-Inhibitor (MDM2) in BM-MSCs hochreguliert. Die Hemmung von MDM2 durch den Inhibitor Siremadlin oder siRNA stellte jedoch die p53-Aktivität in BM-MSCs wieder her. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das aus AML stammende EV-Chromatin über MDM2 eine p53-Dysfunktion in gesunde BM-MSCs verursacht. In Zukunft würde die Aufdeckung der Rolle zusätzlicher Proteine wie S100, die mit EV-Chromatin in BMM assoziiert sind, die Entwicklung vielversprechender Therapeutika zur Behandlung pädiatrischer AML-Patienten ermöglichen.