Effects of hypoxic and inflammatory priming on HIF activation in human leukocytes
Leukocytes need to adapt to different oxygen conditions and hypoxia in short time, especially under pathophysiological conditions when the cells migrate from the bloodstream into inflamed tissue. Hypoxia-inducible factors (HIF) are important transcription factors that mediate cellular adaption to low oxygen supply in all nucleated cells. Moreover, they are essential for effective immune response and leukocyte function. Although inflammation is often associated with hypoxia due to high energy and oxygen demand of inflammatory cells, the interplay of hypoxia and inflammation regarding the HIF pathway remains unresolved. For a more in-depth understanding of immune cell function it is necessary to study the mutual influence of both conditions. To this aim we challenged monocytic THP-1 cells and primary peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in vitro with different concentrations of lipopolysaccharide (E. coli LPS) with or without different combinations of hypoxia or the addition of the HIF-stabilising drug Roxadustat. Additionally, we exposed human subjects in vivo to hypoxia (normobaric, 10.5 % and 15 % oxygen) and simulated acute inflammation using a human endotoxemia protocol with a single intravenous LPS injection (0.4 ng/kg). Our analysis focussed mainly on HIF-1α protein and gene expression changes of specific HIF target genes and inflammatory mediators using Western blotting, immunofluorescent staining, qRT-PCR, and flow cytometry. Our investigations showed differently altered gene expression patterns of HIF and target genes in distinct immune cell subsets (neutrophils, monocytes, T cells) upon in vivo treatment with LPS and hypoxia. Further, we found evidence for highly cell-specific effects of hypoxic priming upon inflammation in combination with immunomodulatory effects in leukocytes in vivo. In cell culture, we observed an increased inflammatory response to LPS after a hypoxic phase in PBMCs and THP-1 cells. Moreover, treatment with the drug and PHD-inhibitor Roxadustat led to increased HIF-1α protein and HIF target gene expression in human leukocytes and promoted the acute inflammatory response to in vitro LPS treatment. In summary, our studies provide valuable insights into the cellular adaption processes of leukocytes during inflammation and hypoxia and highlight the multi-layered interplay between both stimuli.
Leukozyten sind, vor allem unter pathologischen Bedingungen unterschiedlichsten Sauerstoffkonzentrationen und Hypoxie ausgesetzt und müssen ihren Metabolismus innerhalb kürzester Zeit anpassen, um eine wirkungsstarke Immunreaktion bei Entzündungen gewährleisten zu können. Die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) sind wichtige Transkriptionsfaktoren, die die zelluläre Anpassung an eine geringe Sauerstoffversorgung in allen kernhaltigen Zellen vermitteln. Darüber hinaus sind diese Hauptregulatoren für eine wirksame Immunantwort und die Funktion von Leukozyten unerlässlich. Obwohl Entzündungen aufgrund des hohen Energie- und Sauerstoffbedarfs der betroffenen Zellen häufig mit Hypoxie in Verbindung gebracht werden, ist das Zusammenspiel von Sauerstoffmangel und Entzündungen in Bezug auf den HIF-Signalweg noch immer Gegenstand von Untersuchungen. Um die zellulären Anpassungsprozesse in zirkulierenden menschlichen Leukozyten besser zu verstehen, haben wir monozytäre THP-1-Zellen und primäre periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) in vitro mit verschiedenen Kombinationen mit dem immun-stimulierenden Lipopolysaccharid (E. coli LPS), Hypoxie oder dem Medikament Roxadustat behandelt. Zusätzlich wurden freiwillige Probanden in vivo, vor oder nach der Behandlung mit intravenös verabreichtem LPS (0,4 ng/kg) in einem Höhentrainingszentrum niedrigen Sauerstoffkonzentrationen ausgesetzt (normobar, 10,5 % O2) um eine akute Entzündung und Hypoxie zu simulieren. Unsere Forschung konzentrierte sich hauptsächlich auf die Untersuchung der Akkumulation des HIF-1α-Proteins und die Veränderungen der Genexpression spezifischer HIF-Zielgene in Kombination mit Expression von entzündungsfördernden Zytokinen. Dazu nutzen wir die Methoden Western Blotting, Immunfluoreszenzfärbung, qRT-PCR und Durchflusszytometrie. Wir konnten zeigen, dass verschiedene Untergruppen von Immunzellen (Neutrophile, Monozyten, T-Zellen) nach einer in vivo Behandlung mit LPS und Hypoxie unterschiedlich veränderte Genexpressionsmuster von HIF und dessen Zielgenen aufweisen. Darüber hinaus fanden wir Hinweise darauf, dass Leukozyten durch vorangegangene hypoxische Bedingungen hochgradig zellspezifisch reagieren und ihre Genexpression und Immunantwort in Kombination mit simulierter Entzündung verändern. In vitro konnten wir in PBMCs und THP-1-Zellen eine verstärkte Entzündungsreaktion auf LPS nach einer hypoxischen Phase beobachten. Darüber hinaus führte die Behandlung mit dem Medikament und PHD-Inhibitor Roxadustat in Leukozyten zu einem erhöhten HIF-1α-Proteingehalt in Kombination mit einer verstärkten Expression von HIF-Zielgenen und verstärkte die akute Immunreaktion auf LPS. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studien wertvolle Einblicke in die zellulären Anpassungsprozesse von Leukozyten bei Entzündungen und Hypoxie liefern und das vielschichtige Zusammenspiel von beiden betonen.