Die UBX-Domäne von UBXD1 organisiert die Ubiquitinbindung am C-Terminus der AAA-ATPase VCP/p97 zum proteasomalen Abbau

Die AAA-ATPase p97 ist eine ATPase mit unterschiedlichen Funktionen, die durch eine Vielzahl an Cofaktoren ermöglicht werden. UBXD1 ist ein p97-Cofaktor, der eine besondere Rolle einnimmt. Im Gegensatz zu den anderen Cofaktoren besitzt UBXD1 zwei p97- Bindestellen (N-Terminus, PUB-Domäne), sowie einer UBX-Domäne und kann sowohl die NDomäne als auch den C-Terminus von p97 binden. UBXD1 ist in verschiedenen Prozessen wie dem Abbau von Lysosomen und Mitochondrien beteiligt und Störungen führen zur Anhäufung fehlgefalteter Proteine. Obwohl UBXD1 eine wichtige Rolle in diesen Prozessen einnimmt, ist die Funktion dieses Proteins nur unzureichend verstanden. Diese Arbeit konzentriert sich darauf, die Funktion von UBXD1 als Ubiquitinbindungspartner und seinen Einfluss auf den Entfaltungsprozess und die anschließende Prozessierung ubiquitinylierter Substrate zu untersuchen. Durch eine Kombination aus Crosslinking mit massenspektrometrischer Analyse und berechneter Strukturmodelle konnte eine erweiterte UBX-Domäne (eUBX: Linker-UBX, 269-410) im C-terminalen Bereich von UBXD1 als strukturelles Merkmal identifiziert werden, das homolog zur erweiterten UBX-Domäne von ASPL ist. Durch Interaktionsstudien (Fluoreszenzanistropie, Isothermale Titrationskalorimetrie, Crosslinking, Alanin-Scan und Peptid-Array) konnte nachgewiesen werden, dass dieses strukturelle Merkmal effektiv an Ubiquitin und kurze Ubiquitinketten bindet. Zusätzlich konnte die Interaktion zwischen UBXD1 und Ubiquitin NMRspektroskopisch auf atomarer Ebene untersucht werden. Durch die Ausbildung eines - Stranges ist diese erweiterte UBX-Domäne in räumlicher Nähe zur PUB-Domäne assoziiert, die den C-Terminus von p97 bindet. Dieses Modul aus PUB-eUBX ist am C-terminalen Ende des p97-Hexamers lokalisiert und in räumlicher Nähe zur Pore der p97-D2-Domäne. Diese räumliche Nähe ermöglicht es der Linker-Region zwischen der PUB- und UBX-Domäne an die D2-Domäne von p97 zu binden. Mittels detailierter biochemischer Charakterisierung (Fluoreszenzanisotropie mit unterschiedlichen Mutanten und Deletionskonstrukten) konnte in UBXD1 eine dritte p97-Bindestelle identifiziert werden. Durch Aktivitätsassays konnte gezeigt werden, dass UBXD1 keinen Einfluss auf die ATPase-Aktivität während des Entfaltungsprozesses ubiquitinylierter Proteine hat. Dennoch liegt UBXD1 während der Substratentfaltung gebunden an den p97:Ufd1:Npl4-Entfaltungskomplex vor, was darauf hindeutet, dass UBXD1 ungefaltete ubiquitinylierte Substrate nach dem Verlassen der p97- Pore für weitere Prozessierungsschritte bindet. Die Interaktion mit dem Proteasomtransportfaktor HR23 unterstützt diese Hypothese, da sich durch die Bindung der UBL-Domäne an UBXD1 die zuvor geschlossene HR23-Konformaton öffnet und die freien UBA-Domänen das Ubiquitin binden können.

The AAA-ATPase p97 is an ATPase with different functions, depending on the interaction with various cofactors. UBXD1 is a p97 cofactor that plays a special role. In contrast to the other cofactors, UBXD1 has two p97 binding sites and can bind both the N domain and the C terminus of p97. UBXD1 is involved in various processes such as lysosome and mitochondrial degradation and disruption leads to the accumulation of misfolded proteins. Although UBXD1 plays an important role in these processes, the function of this protein is poorly understood. This work focuses on the functional investigation of UBXD1 as a ubiquitin binding partner and its influence on the unfolding processing of ubiquitinylated substrates. Through a combination of crosslinking with mass spectrometric analyses and computed structural models, an extended UBX domain (eUBX: Linker-UBX, 269-410) could be identified as a new structural feature in the C-terminal region of UBXD1. It is homologue to the extended UBX domain of ASPL. Interaction studies (fluorescence anisotropy, isothermal titration calorimetry, crosslinking, an alanine scan and a peptide array) have shown that this structural feature binds effectively to ubiquitin and short ubiquitin chains. In addition, the interaction between UBXD1 and ubiquitin could be studied by NMR spectroscopy at an atomic level. Through the formation of a -strand, this extended UBX domain is associated in close proximity to the PUB domain that binds to the C-terminus of p97. As a result, this PUB-eUBX module is located at the C-terminal end of the p97 hexamer and in close proximity to the pore of the p97 D2 domain. This spatial proximity allows the linker region between the PUB and UBX domains to bind to the D2 domain of p97. In this way, a third p97 binding site could be identified in UBXD1 by detailed biochemical characterization (fluorescence anisotropy with different mutants and deletion constructs). Activity assays showed that UBXD1 has no influence on ATPase activity during the unfolding process of ubiquitinylated proteins. However, UBXD1 is bound to the p97:Ufd1:Npl4 complex during the substrate unfolding, suggesting that UBXD1 binds unfolded ubiquitinylated substrates after exiting the p97 pore for further processing steps. The interaction with the proteasome transport factor HR23 supports this hypothesis, since the binding of the UBL domain to UBXD1 opens the previously closed HR23 conformation and the free UBA domains can bind the ubiquitin.

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