Investigating the role of Threonine aspartase 1 in estrogen-driven transcription
The protease Threonine aspartase 1 (Taspase1) is involved in diverse cellular processes by proteolytic processing of various substrates including MLL (mixed-lineage leukemia) proteins and transcription factor TFIIA. An overexpression of Taspase1 is described for leukemia, solid tumor types and diverse human cancer cell lines. The genetic depletion of Taspase1 in adult mice causes no apparent deficiencies but especially cancer cells are dependent on Taspase1 expression to maintain their proliferation, classifying Taspase1 as a non-oncogene addiction protease. Thus, this protease represents a promising therapeutic target for anti-cancer therapy. However, previous knowledge of Taspase1 is based on its known substrates and high-throughput screenings that allowed the identification of new potential cleavage targets or interaction partners. The small number of previously known Taspase1 interactors might rely on the fact that transient or context-dependent interactions are easily overlooked. This thesis thus aimed for a better understanding of Taspase1´s sphere of activity and strives to unravel its full range of functions. Therefore, one goal of this project was to search for further transient and stable Taspase1 interaction partners to gain a deeper understanding of its overarching molecular function
As such, co-immunoprecipitation experiments and mass spectrometry allowed to identify novel Taspase1 binding partners Nucleolin and Topoisomerase II (Topo II). Previous studies already revealed that Taspase1’s known interaction partner NPM1 together with Nucleolin and Topo II β is able to form a co-repressor complex. The latter is present on promoters of estrogen responsive genes but disassociates rapidly after estrogen treatment. This finding and additional circumstantial evidence suggested a link between Taspase1 and the cellular estrogen response, and therefore further investigations were performed in this regard. Indeed, the TASP1 gene itself is estrogen-responsive demonstrated as Taspase1 was found to be cyclically upregulated upon estrogen stimulation. This is in accordance with the identification of an estrogen response element (ERE) 7.8 kbp upstream of the TASP1 promoter in this thesis. It is known that Topo II β function is essential for the transcriptional activation of hormone-inducible genes. The enzyme generates a transient DNA double strand break (DSB) within the promotor region and resolves topological barriers such as DNA supercoils or knots, thereby allowing the transcription machinery to gain rapid access. In frame of this thesis, Taspase1 could be assigned a direct function in transcriptional activation of estrogen-dependent genes since estrogen treatment leads to a significant increase of Topo II, NPM1, Nucleolin and gH2AX in Taspase1 complexes isolated via co-IPs from chromatin fractions.
As Topo II was identified as an estrogen-dependent component of immunoprecipitated Taspase1-GFP complexes, the possible interplay between Taspase1 and Topo II was subjected to further investigation. Although a shortened Taspase1 cleavage sequence (aa 1249QEDG1252) could be identified in Topo II α, in vivo and in vitro cleavage experiments could not confirm it as a potential Taspase1 substrate. However, this does not exclude the possibility that Taspase1-mediated cleavage of Topo II α might occurs under certain physiological conditions. Moreover, Taspase1 and Topo II co-localized in 293T- and HeLa cells, again hinting towards a functional interplay between these two proteins. In fact, proximity ligation assays could verify a probably direct interaction between Taspase1 and Topo II. Subsequently, the effect of this interplay on hormone-induced DSBs at estrogen-dependent promotors was investigated in vivo and in vitro by a Topo II β cleavage assay. It turned out that Taspase1 directly facilitates Topo II β-mediated DSBs in a dose-dependent manner. It was also revealed that Taspase1 is able to directly bind to DNA, which might explain how Taspase1 positively enhances Topo II β-mediated DSBs.
Furthermore, the results of this thesis unravelled further modes of action for Taspase1 to reinforce the cellular estrogen response: methylation of histone H3 lysine 4 (H3K4me) increases after estrogen stimuli correlating with Taspase1 levels. This indicates that Taspase1 might enables H3K4me epigenetic labelling via cleavage-triggered activation of MLL in an estrogen-dependent manner. Hence, it can be concluded that Taspase1 is also responsible for the necessary epigenetic signature that allows the maintenance of the hormone-activated transcriptional program. Furthermore, Taspase1-depletion studies demonstrated a decline of estrogen-regulated gene expression levels such as c-fos and c-myc, thereby validating the pivotal role of Taspase1 in estrogen-driven transcription.
In sum, the results generated in this thesis demonstrate for the first time that Taspase1’s sphere of activity is embedded in a specific signaling cascade, namely the cellular estrogen pathway. Taspase1 can thus be newly classified as a multi-functioning co-activator of estrogen-driven transcription.
Die Protease Threonin Aspartase 1 (Taspase1) ist für die Spaltung diverser Substrate wie z. B. des MLL (Mixed-Lineage Leukemia)-Proteins oder des Transkriptionsfaktors TFIIA verantwortlich und so in unterschiedliche zelluläre Prozesse involviert. Zudem ist eine Überexpression von Taspase1 für Leukämien wie auch verschiedene solide Tumorarten beschrieben. Taspase1 ist hierbei zur Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps in vielen Tumoren essentiell, wohingegen die genetische Depletion von Taspase1 im adulten Organismus keine schwerwiegenden Auswirkungen zeigt. Somit stellt diese Protease ein vielversprechendes molekulares Angriffsziel für die Krebstherapie dar. Die mangelnden Kenntnisse über Taspase1 lassen sich u. a. damit begründen, dass bisher nur wenige Interaktionspartner dieser Protease identifiziert wurden. Zudem sind zwar einige Substratproteine der Taspase1 bekannt, diese weisen aber kaum funktionelle Gemeinsamkeiten auf, so dass Taspase1 bisher keine übergeordnete Rolle in einem zellulären Prozess oder Signalweg zugeordnet werden konnte. Daher sollten in dieser Arbeit systematisch weitere stabile und transiente Interaktoren identifiziert werden, um anhand der funktionalen Schnittmenge der bekannten und neu identifizierten Interaktionspartner Rückschlüsse auf die zentrale Funktion und das gesamte Wirkungsspektrum der Taspase1 ziehen zu können.
Mittels co-Immunpräzipitationsexperimenten (co-IPs) und Massenspektrometrie konnten u. a. Nucleolin und Topoisomerase II (Topo II) als neue Bindungspartner der Taspase1 identifiziert werden. Für diese Proteine ist beschrieben, dass sie gemeinsam mit dem bereits bekannten Taspase1-Interaktionspartner Nucleophosmin 1 (NPM1) einen co‑Repressorkomplex ausbilden können, der an Promotorbereiche Östrogen-abhängiger Gene bindet, jedoch nach einer Steroidbehandlung wieder dissoziiert. Dieser Befund und zusätzliche Indizien deuteten auf einen Zusammenhang von Taspase1 und der zellulären Östrogenantwort, der im Folgenden weiter untersucht werden sollte. Tatsächlich konnte TASP1 als östrogen-abhängiges Gen charakterisiert werden, welches nach Östrogenstimulus zyklisch hochreguliert wird. Die Identifizierung eines Östrogen-Response-Elements (ERE) 7,8 kbp strangaufwärts des TASP1-Promotors unterstreicht dies ebenfalls.
Es ist bekannt, dass das Enzym Topo II β bei der Transkriptionsinitiation Hormon-regulierter Gene eine essentielle Funktion ausübt. Im Promoterbereich werden durch Topoisomerasen transiente DNS-Doppelstrangbrüche erzeugt, um so vorhandene topologische Barrieren wie superspiralisierte oder verknotete DNS zu entfernen. In der Tat konnte im Rahmen dieser Arbeit eine direkte Funktion der Taspase1 in diesem essentiellen Prozess der Transkriptionsaktivierung Hormon-induzierter Gene nachgewiesen werden. Mittels co-IP isolierte Taspase1-Komplexe wiesen nach Östrogenexposition eine starke Akkumulation der an diesem Prozess maßgeblich beteiligten Proteine einschließlich Topo II auf.
Da eine östrogenabhängige Assoziation von Topo II mit immunpräzipitierter Taspase1-GFP identifiziert werden konnte, wurde im Folgenden das Zusammenspiel zwischen Taspase1 und Topo II detaillierter untersucht. Zum einen konnte innerhalb der Topo II α-Sequenz eine einfache Taspase1-Konsensus-Spaltsequenz (1249QEDG1252) identifiziert werden. In vivo-und in vitro-Spaltungsexperimente konnten jedoch nicht bestätigen, dass Topo II α tatsächlich ein Taspase1-Substrat darstellt. Dies schließt allerdings nicht aus, dass eine Taspase1-vermittelte Spaltung von Topo II α unter bestimmten Umgebungsbedingungen dennoch stattfindet. Dies könnte durchaus Gegenstand weiterführender Untersuchungen sein.
Die beobachtete Kolokalisation von Taspase1 und Topo II in 293T- und HeLa-Zellen lieferte einen weiteren Hinweis für einen funktionellen Zusammenhang zwischen den beiden Proteinen. Tatsächlich zeigten proximity ligation assays, dass es sich bei der Interaktion von Taspase1 und Topo II vermutlich um eine direkte Protein-Protein-Interaktion handelt. Daraufhin stellte sich die Frage, wie diese direkte Taspase1‑Topo II-Wechselwirkung hormoninduzierte DNS-Doppelstrangbruch an Östrogen-abhängigen Promotoren beeinflusst. In vitro-Experimente mit rekombinanter Topo II β und Taspase1-His zeigten, dass Taspase1-His in konzentrationsabhängiger Weise die Entstehung Topo II β-katalysierter Doppelstrangbrüche in Plasmid-DNS verstärkt. Mittels Affinitätselektrophorese konnte gezeigt werden, dass Taspase1 an DNS binden kann. Diese neu identifizierte Eigenschaft von Taspase1 könnte eine Erklärung dafür liefern, dass diese Protease in der Lage ist, die enzymatische Aktivität von Topo II β positiv zu beeinflussen. So könnte postuliert werden, dass Taspase1 die Bindung von Topo II an die DNS erleichtert bzw. Topo II zu bestimmten DNS-Sequenzen rekrutiert.
Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass Taspase1 den Östrogen-Signalweg auch auf weiteren Ebenen beeinflusst. Die Spaltung von Taspase1-Substratproteinen führte zu einer Veränderung der Genexpressionsmuster nach Hormon-Stimulus der Zelle. Beispielsweise führte die Östrogen-Behandlung von 293T-Zellen auch zu einer Erhöhung der H3K4-Methylierung, einer mit Gen-Aktivierung assoziierten epigenetischen Modifikation. Da die Spaltung des MLL-Proteins durch Taspase1 die Voraussetzung für eine effiziente MLL-vermittelte H3K4-Methylierung darstellt, kann geschlussfolgert werden, dass erst die Östrogen-induzierte Hochregulation von Taspase1 den im gleichen Zeitfenster erscheinenden Anstieg der H3K4-Methylierung ermöglicht. Durch diese indirekte Modulation der epigenetischen H3K4-Signatur trägt Taspase1 somit vermutlich auch zur länger andauernden Aktivierung von Östrogen-bedingten genetischen Programmen bei.
Die im Rahmen dieser Arbeit neu identifizierte Funktion von Taspase1 im Östrogen-Signalweg konnte weiterhin durch Taspase1-Depletionsstudien bestätigt werden. Nach siRNA-vermittelter Taspase1-Depletion wurden insbesondere verminderte Expressionsmengen Östrogen-regulierter Gene wie c-fos und c-myc nachgewiesen.
Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation Taspase1 einem übergeordneten Signalweg, und zwar dem zellulären Östrogenweg zugeordnet werden. In diesem Kontext wurde Taspase1 als multifunktionaler Koaktivator der Östrogen-vermittelten Transkriptionsaktivierung charakterisiert.
Vorschau
Zitieren
Rechte
Nutzung und Vervielfältigung:
Dieses Werk kann unter einer
Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz (CC BY 4.0)
genutzt werden.